Le nombre de microtubules attachés à un cinétochore est variable : chez Saccharomyces cerevisiae, une seule MT se lie à chaque cinétochore, alors que chez les mammifères, il peut y avoir 15 à 35 MT liées à chaque cinétochore. Cependant, toutes les MT du fuseau ne se fixent pas à un seul kinétochore. Certaines MT s’étendent d’un centrosome à l’autre (et sont responsables de la longueur du fuseau) et d’autres plus courtes sont interdigitées entre les longues MT. Le professeur B. Nicklas (Duke University) a montré que, si l’on brise l’attachement MT-kinétochore à l’aide d’un faisceau laser, les chromatides ne peuvent plus se déplacer, ce qui entraîne une distribution anormale des chromosomes. Ces expériences ont également montré que les cinétochores ont une polarité, et que l’attachement des cinétochores aux MTs émanant de l’un ou l’autre centrosome va dépendre de son orientation. Cette spécificité garantit qu’une seule chromatide se déplacera vers chaque côté du fuseau, assurant ainsi une distribution correcte du matériel génétique. Ainsi, l’une des fonctions de base du kinétochore est l’attachement de la MT au fuseau, qui est essentiel pour ségréguer correctement les chromatides sœurs. Si l’ancrage est incorrect, des erreurs peuvent s’ensuivre, générant une aneuploïdie, avec des conséquences catastrophiques pour la cellule. Pour éviter cela, il existe des mécanismes de détection et de correction des erreurs (comme le point de contrôle de l’assemblage du fuseau), dont les composants se trouvent également sur les kinétochores. Le mouvement d’une chromatide vers le centrosome est produit principalement par la dépolymérisation de la MT dans le site de liaison avec le kinétochore. Ces mouvements nécessitent également une génération de force, impliquant des moteurs moléculaires également situés sur les kinétochores.
Ancrage des chromosomes aux MTs dans le fuseau mitotiqueEdit
Capture des MTsEdit
Pendant la phase de synthèse (phase S) du cycle cellulaire, le centrosome commence à se dupliquer. Juste au début de la mitose, les deux centrioles de chaque centrosome atteignent leur longueur maximale, les centrosomes recrutent du matériel supplémentaire et leur capacité de nucléation des microtubules augmente. À mesure que la mitose progresse, les deux centrosomes se séparent pour établir le fuseau mitotique. Ainsi, le fuseau d’une cellule mitotique possède deux pôles d’où émanent les microtubules. Les microtubules sont de longs filaments protéiques dont les extrémités sont asymétriques, une extrémité « moins » (-) relativement stable à côté du centrosome, et une extrémité « plus » (+) endurant des phases alternées de croissance-rétrécissement, explorant le centre de la cellule. Au cours de ce processus de recherche, un microtubule peut rencontrer et capturer un chromosome par le biais du kinétochore. Les microtubules qui trouvent et fixent un kinétochore se stabilisent, tandis que les microtubules qui restent libres se dépolymérisent rapidement. Comme les chromosomes ont deux kinétochores associés dos à dos (un sur chaque chromatide sœur), lorsque l’un d’eux s’attache aux microtubules générés par l’un des pôles cellulaires, le kinétochore de la chromatide sœur est exposé au pôle opposé ; pour cette raison, la plupart du temps, le second kinétochore s’attache aux microtubules émanant du pôle opposé, de telle sorte que les chromosomes sont maintenant bi-orientés, une configuration fondamentale (également appelée amphitelique) pour assurer la ségrégation correcte des deux chromatides lorsque la cellule se divisera.
Lorsqu’un seul microtubule est ancré à un kinétochore, il déclenche un mouvement rapide du chromosome associé vers le pôle générant ce microtubule. Ce mouvement est probablement médié par l’activité motrice vers le « moins » (-) de la protéine motrice dynéine cytoplasmique, qui est très concentrée dans les kinétochores non ancrés aux MTs. Le mouvement vers le pôle est ralenti dans la mesure où les kinétochores acquièrent des kMTs (MTs ancrées aux kinétochores) et le mouvement devient dirigé par les changements de longueur des kMTs. La dynéine est libérée des kinétochores lorsqu’ils acquièrent des kMTs et, dans les cellules de mammifères en culture, elle est nécessaire pour l’inactivation du point de contrôle du fuseau, mais pas pour la congestion des chromosomes dans l’équateur du fuseau, l’acquisition des kMTs ou l’anaphase A pendant la ségrégation des chromosomes. Chez les plantes supérieures ou chez la levure, il n’y a aucune preuve de la présence de la dynéine, mais d’autres kinésines vers l’extrémité (-) pourraient compenser l’absence de dynéine.
Une autre protéine motrice impliquée dans la capture initiale des MT est CENP-E ; il s’agit d’une kinésine de haut poids moléculaire associée à la couronne fibreuse au niveau des kinétochores des mammifères de la prométaphase jusqu’à l’anaphase. Dans les cellules présentant de faibles niveaux de CENP-E, les chromosomes sont dépourvus de cette protéine au niveau de leurs cinétochores, qui sont très souvent défectueux dans leur capacité à se réunir à la plaque de métaphase. Dans ce cas, certains chromosomes peuvent rester chroniquement mono-orientés (ancrés à un seul pôle), bien que la plupart des chromosomes puissent se congruire correctement à la plaque de métaphase.
Il est largement admis que la fibre kMTs (le faisceau de microtubules liés au kinétochore) a pour origine la capture de MTs polymérisées au niveau des centrosomes et des pôles du fuseau dans les cellules mammifères en culture. Cependant, les MTs directement polymérisées au niveau des kinétochores pourraient également y contribuer de manière significative. La manière dont la région centromérique ou le kinétochore initie la formation des kMT et la fréquence à laquelle cela se produit sont des questions importantes, car ce mécanisme peut contribuer non seulement à la formation initiale des kMT, mais aussi à la manière dont les kinétochores corrigent l’ancrage défectueux des MTs et régulent le mouvement le long des kMTs.
Rôle du complexe Ndc80Edit
Les MTs associées aux kinétochores présentent des caractéristiques particulières : par rapport aux MTs libres, les kMTs sont beaucoup plus résistantes à la dépolymérisation induite par le froid, aux pressions hydrostatiques élevées ou à l’exposition au calcium. En outre, les kMTs sont recyclées beaucoup plus lentement que les MTs astrales et les MTs du fuseau avec des extrémités libres (+), et si les kMTs sont libérées des kinétochores à l’aide d’un faisceau laser, elles se dépolymérisent rapidement.
Lorsqu’il était clair que ni la dynéine ni la CENP-E ne sont essentielles à la formation des kMTs, d’autres molécules devaient être responsables de la stabilisation des kMTs. Des travaux de génétique pionnière chez la levure ont révélé la pertinence du complexe Ndc80 dans l’ancrage des kMTs. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe Ndc80 comporte quatre composants : Ndc80p, Nuf2p, Spc24p et Spc25p. Les mutants dépourvus de l’un des composants de ce complexe présentent une perte de la connexion kinétochore-microtubules, bien que la structure du kinétochore ne soit pas complètement perdue. Pourtant, les mutants dans lesquels la structure du kinétochore est perdue (par exemple les mutants Ndc10 chez la levure) sont déficients à la fois dans la connexion aux microtubules et dans la capacité à activer le point de contrôle du fuseau, probablement parce que les kinétochores fonctionnent comme une plateforme dans laquelle les composants de la réponse sont assemblés.
Le complexe Ndc80 est hautement conservé et il a été identifié chez S. pombe, C. elegans, Xenopus, le poulet et les humains. Des études sur Hec1 (highly expressed in cancer cells 1), l’homologue humain de Ndc80p, montrent qu’il est important pour la congestion correcte des chromosomes et la progression mitotique, et qu’il interagit avec des composants des complexes cohésine et condensine.
Différents laboratoires ont montré que le complexe Ndc80 est essentiel pour la stabilisation de l’ancrage kinétochore-microtubules, nécessaire pour soutenir la tension centromérique impliquée dans l’établissement de la congestion correcte des chromosomes chez les eucaryotes supérieurs. Les cellules dont la fonction de Ndc80 est altérée (en utilisant l’ARNi, le knockout génique ou la micro-injection d’anticorps) présentent des fuseaux anormalement longs, un manque de tension entre les kinétochores sœurs, des chromosomes incapables de se rassembler sur la plaque de métaphase et peu ou pas de kMTs associés.
Il existe une variété de supports solides pour la capacité du complexe Ndc80 à s’associer directement aux microtubules et à former le composant central conservé de l’interface kinétochore-microtubules. Cependant, la formation d’interactions robustes entre le kinétochore et les microtubules peut également nécessiter la fonction de protéines supplémentaires. Chez la levure, cette connexion requiert la présence du complexe Dam1-DASH-DDD. Certains membres de ce complexe se lient directement aux MTs, tandis que d’autres se lient au complexe Ndc80. Cela signifie que le complexe Dam1-DASH-DDD pourrait être un adaptateur essentiel entre les kinétochores et les microtubules. Cependant, chez les animaux, un complexe équivalent n’a pas été identifié, et cette question fait encore l’objet d’intenses investigations.
Vérification de l’ancrage kinétochore-MTEdit
Pendant la phase S, la cellule duplique toute l’information génétique stockée dans les chromosomes, lors du processus appelé réplication de l’ADN. À la fin de ce processus, chaque chromosome comprend deux chromatides sœurs, qui sont deux molécules d’ADN complètes et identiques. Les deux chromatides restent associées par des complexes de cohésine jusqu’à l’anaphase, moment où se produit la ségrégation des chromosomes. Si la ségrégation des chromosomes se déroule correctement, chaque cellule fille reçoit un ensemble complet de chromatides, et pour cela, chaque chromatide sœur doit s’ancrer (par le biais du kinétochore correspondant) aux MT générées dans les pôles opposés du fuseau mitotique. Cette configuration est qualifiée d’amphitryon ou de bi-orientation.
Cependant, au cours du processus d’ancrage, certaines configurations incorrectes peuvent également apparaître :
- monotélique : une seule des chromatides est ancrée aux MTs, le second kinétochore n’est pas ancré ; dans cette situation, il n’y a pas de tension centromérique, et le point de contrôle du fuseau est activé, retardant l’entrée en anaphase et laissant le temps à la cellule de corriger l’erreur. Si elle n’est pas corrigée, la chromatide non ancrée pourrait se terminer de manière aléatoire dans l’une des deux cellules filles, générant une aneuploïdie : une cellule fille aurait des chromosomes en excès et l’autre manquerait de certains chromosomes.
- syntélique : les deux chromatides sont ancrées à des MTs émanant du même pôle ; cette situation ne génère pas non plus de tension centromérique, et le point de contrôle du fuseau sera activé. S’il n’est pas corrigé, les deux chromatides se termineront dans la même cellule fille, générant une aneuploïdie.
- mérotélique : au moins une chromatide est ancrée simultanément à des MTs émanant des deux pôles. Cette situation génère une tension centromérique, et pour cette raison, le point de contrôle du fuseau n’est pas activé. S’il n’est pas corrigé, la chromatide liée aux deux pôles restera comme un chromosome retardataire à l’anaphase, et finalement sera cassée en deux fragments, distribués entre les cellules filles, générant une aneuploïdie.
Les configurations monotélique et syntélique ne parviennent pas à générer une tension centromérique et sont détectées par le point de contrôle du fuseau. En revanche, la configuration mérotélique n’est pas détectée par ce mécanisme de contrôle. Cependant, la plupart de ces erreurs sont détectées et corrigées avant que la cellule n’entre en anaphase. Un facteur clé dans la correction de ces erreurs d’ancrage est le complexe passager chromosomique, qui comprend la protéine kinase Aurora B, sa sous-unité cible et activatrice INCENP et deux autres sous-unités, Survivin et Borealin/Dasra B (revue par Adams et collaborateurs en 2001). Les cellules dans lesquelles la fonction de ce complexe a été abolie par des mutants dominants négatifs, l’ARNi, la micro-injection d’anticorps ou l’utilisation de médicaments sélectifs, accumulent des erreurs d’ancrage des chromosomes. De nombreuses études ont montré qu’Aurora B est nécessaire pour déstabiliser l’ancrage incorrect kinétochore-MT, favorisant la génération de connexions amphitéliques. L’homologue d’Aurora B chez la levure (Ipl1p) phosphore certaines protéines du kinétochore, comme la protéine constitutive Ndc10p et les membres des complexes Ndc80 et Dam1-DASH-DDD. La phosphorylation des composants du complexe Ndc80 produit une déstabilisation de l’ancrage des kinétochores. Il a été proposé que la localisation d’Aurora B soit importante pour sa fonction : comme elle est située dans la région interne du kinétochore (dans l’hétérochromatine centromérique), lorsque la tension centromérique est établie, les kinétochores sœurs se séparent, et Aurora B ne peut pas atteindre ses substrats, de sorte que les kMTs sont stabilisées. Aurora B est fréquemment surexprimé dans plusieurs types de cancer, et il est actuellement une cible pour le développement de médicaments anticancéreux.
Activation du point de contrôle du fuseauModifier
Le point de contrôle du fuseau, ou SAC (pour spindle assembly checkpoint), également appelé point de contrôle mitotique, est un mécanisme cellulaire responsable de la détection de :
- l’assemblage correct du fuseau mitotique ;
- l’attachement de tous les chromosomes au fuseau mitotique de manière bipolaire ;
- la congression de tous les chromosomes au niveau de la plaque de métaphase.
Lorsqu’un seul chromosome (quelle qu’en soit la raison) reste en retard lors de la congression, la machinerie du point de contrôle du fuseau génère un retard dans la progression du cycle cellulaire : la cellule est arrêtée, laissant le temps aux mécanismes de réparation de résoudre le problème détecté. Après un certain temps, si le problème n’a pas été résolu, la cellule sera ciblée pour l’apoptose (mort cellulaire programmée), un mécanisme de sécurité pour éviter la génération d’une aneuploïdie, une situation qui a généralement des conséquences dramatiques pour l’organisme.
Alors que les protéines centromériques structurelles (telles que CENP-B), restent localisées de manière stable tout au long de la mitose (y compris pendant la télophase), les composants du point de contrôle du fuseau sont assemblés sur le kinétochore en concentrations élevées en l’absence de microtubules, et leurs concentrations diminuent à mesure que le nombre de microtubules attachés au kinétochore augmente.
À la métaphase, les niveaux de CENP-E, Bub3 et Bub1 diminuent de 3 à 4 fois par rapport aux niveaux des kinétochores non attachés, tandis que les niveaux de dynéine/dynactine, Mad1, Mad2 et BubR1 diminuent >10-100 fois. Ainsi, en métaphase, lorsque tous les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, toutes les protéines de checkpoint sont libérées du kinétochore. La disparition des protéines de checkpoint hors des kinétochores indique le moment où le chromosome a atteint la plaque de métaphase et est sous tension bipolaire. A ce moment, les protéines de checkpoint qui se lient à Cdc20 et l’inhibent (Mad1-Mad2 et BubR1), libèrent Cdc20, qui se lie et active APC/CCdc20, et ce complexe déclenche la séparation des chromatides sœurs et par conséquent l’entrée en anaphase.
Plusieurs études indiquent que le complexe Ndc80 participe à la régulation de l’association stable de Mad1-Mad2 et de la dynéine avec les kinétochores. Pourtant, les protéines associées aux kinétochores CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H et BubR1 sont indépendantes de Ndc80/Hec1. L’arrêt prolongé en prométaphase observé dans les cellules avec de faibles niveaux de Ndc80/Hec1 dépend de Mad2, bien que ces cellules présentent de faibles niveaux de Mad1, Mad2 et dynéine sur les kinétochores (<10-15% par rapport aux kinétochores non attachés). Cependant, si les niveaux de Ndc80/Hec1 et de Nuf2 sont réduits, Mad1 et Mad2 disparaissent complètement des kinétochores et le point de contrôle du fuseau est inactivé.
Les shugoshines (Sgo1, MEI-S332 chez Drosophila melanogaster) sont des protéines centromériques qui sont essentielles pour maintenir la cohésine liée aux centromères jusqu’à l’anaphase. L’homologue humain, hsSgo1, s’associe aux centromères pendant la prophase et disparaît lorsque l’anaphase commence. Lorsque les niveaux de Shugoshin sont réduits par ARNi dans les cellules HeLa, la cohésine ne peut pas rester sur les centromères pendant la mitose et, par conséquent, les chromatides sœurs se séparent de manière synchrone avant le début de l’anaphase, ce qui déclenche un long arrêt mitotique.
D’autre part, Dasso et ses collaborateurs ont découvert que les protéines impliquées dans le cycle Ran peuvent être détectées sur les cinétochores pendant la mitose : RanGAP1 (une protéine d’activation de la GTPase qui stimule la conversion de Ran-GTP en Ran-GDP) et la protéine de liaison de Ran appelée RanBP2/Nup358. Pendant l’interphase, ces protéines sont localisées au niveau des pores nucléaires et participent au transport nucléo-cytoplasmique. La localisation au kinétochore de ces protéines semble avoir une importance fonctionnelle, car certains traitements qui augmentent les niveaux de Ran-GTP inhibent la libération au kinétochore de Bub1, Bub3, Mad2 et CENP-E.
Orc2 (une protéine qui appartient au complexe de reconnaissance des origines -ORC- impliqué dans l’initiation de la réplication de l’ADN pendant la phase S) est également localisé au niveau des cinétochores pendant la mitose dans les cellules humaines ; en accord avec cette localisation, certaines études indiquent que Orc2 dans la levure est impliqué dans la cohésion des chromatides sœurs, et lorsqu’il est éliminé de la cellule, l’activation du point de contrôle du fuseau s’ensuit. Certains autres composants de l’ORC (comme orc5 chez S. pombe) ont également été trouvés pour participer à la cohésion. Cependant, les protéines ORC semblent participer à une voie moléculaire qui s’ajoute à la voie de la cohésine, et elle est pour la plupart inconnue.
Génération de force pour propulser le mouvement des chromosomesEdit
La plupart des mouvements des chromosomes par rapport aux pôles du fuseau sont associés à l’allongement et au raccourcissement des kMT. L’une des caractéristiques les plus intéressantes des cinétochores est leur capacité à modifier l’état de leurs kMTs associés (environ 20) d’un état de dépolymérisation à leur extrémité (+) à un état de polymérisation. Cela permet aux kinétochores des cellules en prométaphase de montrer une » instabilité directionnelle « , changeant entre des phases persistantes de mouvement vers le pôle (poleward) ou inversé (anti-poleward), qui sont couplées avec des états alternés de dépolymérisation et de polymérisation des kMTs, respectivement. Cette bi-stabilité des kinétochores semble faire partie d’un mécanisme permettant d’aligner les chromosomes à l’équateur du fuseau sans perdre la connexion mécanique entre les kinétochores et les pôles du fuseau. On pense que la bi-stabilité des kinétochores est basée sur l’instabilité dynamique de l’extrémité (+) des kMT, et qu’elle est partiellement contrôlée par la tension présente au niveau des kinétochores. Dans les cellules de mammifères en culture, une faible tension au niveau des kinétochores favorise le changement vers la dépolymérisation des kMTs, et une tension élevée favorise le changement vers la polymérisation des kMTs.
Les protéines du kinétochore et les protéines se liant à l’extrémité (+) des MTs (collectivement appelées +TIP) régulent le mouvement du kinétochore par la régulation de la dynamique de l’extrémité (+) des kMTs. Cependant, l’interface kinétochore-microtubules est hautement dynamique, et certaines de ces protéines semblent être des composants de bonne foi des deux structures. Deux groupes de protéines semblent être particulièrement importants : les kinésines qui fonctionnent comme des dépolymérases, comme les kinésines KinI ; et les protéines liées aux extrémités (+) des MT, les +TIP, favorisant la polymérisation, antagonisant peut-être l’effet des dépolymérases.
- Les kinésines KinI sont nommées « I » car elles présentent un domaine moteur interne, qui utilise l’ATP pour favoriser la dépolymérisation du polymère de tubuline, le microtubule. Chez les vertébrés, la kinésine KinI la plus importante contrôlant la dynamique de l’assemblage de l’extrémité (+) est MCAK. Cependant, il semble que d’autres kinésines soient impliquées.
- Il existe deux groupes de +TIP ayant des fonctions de kinétochores.
- Le premier comprend la protéine adenomatous polyposis coli (APC) et la protéine associée EB1, qui ont besoin des MTs pour se localiser sur les kinétochores. Les deux protéines sont nécessaires à la ségrégation correcte des chromosomes. EB1 ne se lie qu’aux MTs en état de polymérisation, ce qui suggère qu’elle favorise la stabilisation des kMTs pendant cette phase.
- Le deuxième groupe de +TIP comprend des protéines qui peuvent se localiser sur les kinétochores même en l’absence de MTs. Dans ce groupe, il y a deux protéines qui ont été largement étudiées : CLIP-170 et leurs protéines associées CLASPs (CLIP-associated proteins). Le rôle de CLIP-170 au niveau des kinétochores est inconnu, mais l’expression d’un mutant dominant négatif produit un retard de prométaphase, suggérant qu’elle a un rôle actif dans l’alignement des chromosomes. Les protéines CLASPs sont nécessaires à l’alignement des chromosomes et au maintien d’un fuseau bipolaire chez la drosophile, l’homme et la levure.