El número de microtúbulos unidos a un cinetocoro es variable: en Saccharomyces cerevisiae sólo un MT se une a cada cinetocoro, mientras que en los mamíferos puede haber entre 15 y 35 MT unidos a cada cinetocoro. Sin embargo, no todas las MT del huso se unen a un cinetocoro. Hay MT que se extienden de un centrosoma a otro (y son responsables de la longitud del huso) y algunas más cortas se interdigitan entre las MT largas. El profesor B. Nicklas (Universidad de Duke), demostró que, si se rompe la unión entre las MT y el cinetocoro mediante un rayo láser, las cromátidas ya no pueden moverse, lo que provoca una distribución anormal de los cromosomas. Estos experimentos también demostraron que los cinetocoros tienen polaridad, y que la fijación del cinetocoro a las MT que emanan de uno u otro centrosoma dependerá de su orientación. Esta especificidad garantiza que sólo una cromátida se desplazará hacia cada lado del huso, asegurando así la correcta distribución del material genético. Así, una de las funciones básicas del cinetocoro es la fijación del MT al huso, que es esencial para la correcta segregación de las cromátidas hermanas. Si el anclaje es incorrecto, pueden producirse errores que generen aneuploidía, con consecuencias catastróficas para la célula. Para evitar que esto ocurra, existen mecanismos de detección y corrección de errores (como el punto de control del ensamblaje del huso), cuyos componentes residen también en los cinetocoros. El movimiento de una cromátida hacia el centrosoma se produce principalmente por la despolimerización del MT en el sitio de unión con el cinetocoro. Estos movimientos requieren también la generación de fuerza, en la que intervienen motores moleculares situados igualmente en los cinetocoros.
Anclaje de cromosomas a MTs en el huso mitóticoEditar
Captación de MTsEditar
Durante la fase de síntesis (fase S) en el ciclo celular, el centrosoma comienza a duplicarse. Justo al comienzo de la mitosis, los dos centriolos de cada centrosoma alcanzan su máxima longitud, los centrosomas reclutan material adicional y su capacidad de nucleación de microtúbulos aumenta. A medida que la mitosis avanza, ambos centrosomas se separan para establecer el huso mitótico. De este modo, el huso de una célula mitótica tiene dos polos que emanan microtúbulos. Los microtúbulos son largos filamentos proteicos con extremos asimétricos, un extremo «menos»(-) relativamente estable junto al centrosoma, y un extremo «más»(+) que soporta fases alternas de crecimiento-encogimiento, explorando el centro de la célula. Durante este proceso de búsqueda, un microtúbulo puede encontrar y capturar un cromosoma a través del cinetocoro. Los microtúbulos que encuentran y fijan un cinetocoro se estabilizan, mientras que los microtúbulos que quedan libres se despolimerizan rápidamente. Como los cromosomas tienen dos cinetocoros asociados espalda con espalda (uno en cada cromátida hermana), cuando uno de ellos se une a los microtúbulos generados por uno de los polos celulares, el cinetocoro de la cromátida hermana queda expuesto al polo opuesto; por esta razón, la mayoría de las veces el segundo cinetocoro se une a los microtúbulos que emanan del polo opuesto, de manera que los cromosomas pasan a estar biorientados, una configuración fundamental (también denominada anfitélica) para asegurar la correcta segregación de ambas cromátidas cuando la célula se va a dividir.
Cuando un solo microtúbulo se ancla a un cinetocoro, inicia un rápido movimiento del cromosoma asociado hacia el polo que genera ese microtúbulo. Este movimiento está probablemente mediado por la actividad motora hacia el «menos» (-) de la proteína motora dineína citoplasmática, que está muy concentrada en los cinetocoros no anclados a los MT. El movimiento hacia el polo se ralentiza a medida que los cinetocoros adquieren kMTs (MTs anclados a los cinetocoros) y el movimiento pasa a ser dirigido por los cambios de longitud de los kMTs. La dineína se libera de los cinetocoros a medida que adquieren los kMTs y, en las células de mamífero cultivadas, es necesaria para la inactivación del punto de control del huso, pero no para la congresión cromosómica en el ecuador del huso, la adquisición de los kMTs o la anafase A durante la segregación cromosómica. En plantas superiores o en levaduras no hay evidencia de dineína, pero otras quinesinas hacia el extremo (-) podrían compensar la falta de dineína.
Otra proteína motora implicada en la captura inicial de los MT es CENP-E; se trata de una kinesina de alto peso molecular asociada a la corona fibrosa en los cinetocoros de mamíferos desde la prometafase hasta la anafase. En las células con niveles bajos de CENP-E, los cromosomas carecen de esta proteína en sus cinetocoros, que con bastante frecuencia son defectuosos en su capacidad de congresión en la placa metafásica. En este caso, algunos cromosomas pueden permanecer crónicamente monoorientados (anclados a un solo polo), aunque la mayoría de los cromosomas pueden congresar correctamente en la placa metafásica.
Es ampliamente aceptado que la fibra de los kMTs (el haz de microtúbulos unidos al cinetocoro) se origina por la captación de MTs polimerizados en los centrosomas y polos del huso en las células cultivadas de mamíferos. Sin embargo, los MTs polimerizados directamente en los cinetocoros también podrían contribuir significativamente. La forma en que la región centromérica o el cinetocoro inicia la formación de los kMTs y la frecuencia con la que esto ocurre son cuestiones importantes, porque este mecanismo puede contribuir no sólo a la formación inicial de los kMTs, sino también a la forma en que los cinetocoros corrigen el anclaje defectuoso de los MTs y regulan el movimiento a lo largo de los kMTs.
Papel del complejo Ndc80
Las MTs asociadas a los cinetocoros presentan características especiales: en comparación con las MTs libres, las kMTs son mucho más resistentes a la despolimerización inducida por el frío, a las altas presiones hidrostáticas o a la exposición al calcio. Además, los kMTs se reciclan mucho más lentamente que los MTs astrales y los MTs del huso con extremos libres (+), y si los kMTs se liberan de los cinetocoros utilizando un rayo láser, se despolimerizan rápidamente.
Cuando quedó claro que ni la dineína ni el CENP-E son esenciales para la formación de los kMTs, otras moléculas deberían ser responsables de la estabilización de los kMTs. Los trabajos genéticos pioneros en levadura revelaron la relevancia del complejo Ndc80 en el anclaje de los kMTs. En Saccharomyces cerevisiae, el complejo Ndc80 tiene cuatro componentes: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p y Spc25p. Los mutantes que carecen de alguno de los componentes de este complejo muestran una pérdida de la conexión cinetocoro-microtúbulos, aunque la estructura del cinetocoro no se pierde por completo. Sin embargo, los mutantes en los que se pierde la estructura del cinetocoro (por ejemplo, los mutantes Ndc10 en levadura) son deficientes tanto en la conexión con los microtúbulos como en la capacidad de activar el punto de control del huso, probablemente porque los cinetocoros funcionan como una plataforma en la que se ensamblan los componentes de la respuesta.
El complejo Ndc80 está muy conservado y se ha identificado en S. pombe, C. elegans, Xenopus, pollo y humanos. Los estudios sobre Hec1 (altamente expresado en células cancerosas 1), el homólogo humano de Ndc80p, muestran que es importante para la correcta congresión cromosómica y la progresión mitótica, y que interactúa con componentes de los complejos de cohesina y condensina.
Diferentes laboratorios han demostrado que el complejo Ndc80 es esencial para la estabilización del anclaje cinetocoro-microtúbulos, necesario para soportar la tensión centromérica implicada en el establecimiento de la correcta congresión cromosómica en eucariotas altos. Las células con una función deteriorada de Ndc80 (mediante ARNi, knockout del gen o microinyección de anticuerpos) tienen husos anormalmente largos, falta de tensión entre los cinetocoros hermanos, cromosomas incapaces de congregarse en la placa metafásica y pocos o ningún kMT asociado.
Hay una variedad de apoyos fuertes para la capacidad del complejo Ndc80 de asociarse directamente con los microtúbulos y formar el componente central conservado de la interfaz cinetocoro-microtúbulos. Sin embargo, la formación de interacciones robustas entre el cinetocoro y los microtúbulos también puede requerir la función de proteínas adicionales. En la levadura, esta conexión requiere la presencia del complejo Dam1-DASH-DDD. Algunos miembros de este complejo se unen directamente a los MT, mientras que otros se unen al complejo Ndc80. Esto significa que el complejo Dam1-DASH-DDD podría ser un adaptador esencial entre los cinetocoros y los microtúbulos. Sin embargo, en animales no se ha identificado un complejo equivalente, y esta cuestión sigue siendo objeto de intensa investigación.
Verificación del anclaje cinetocoro-MTEditar
Durante la fase S, la célula duplica toda la información genética almacenada en los cromosomas, en el proceso denominado replicación del ADN. Al final de este proceso, cada cromosoma incluye dos cromátidas hermanas, que son dos moléculas de ADN completas e idénticas. Ambas cromátidas permanecen asociadas por complejos de cohesina hasta la anafase, cuando se produce la segregación cromosómica. Si la segregación cromosómica se produce correctamente, cada célula hija recibe un juego completo de cromátidas, y para ello cada cromátida hermana tiene que anclarse (a través del cinetocoro correspondiente) a los MT generados en polos opuestos del huso mitótico. Esta configuración se denomina anfitélica o de biorientación.
Sin embargo, durante el proceso de anclaje también pueden aparecer algunas configuraciones incorrectas:
- monotélico: sólo una de las cromátidas está anclada a los MT, el segundo cinetocoro no está anclado; en esta situación, no hay tensión centromérica, y se activa el punto de control del huso, retrasando la entrada en anafase y dando tiempo a la célula a corregir el error. Si no se corrige, la cromátida no anclada podría terminar aleatoriamente en cualquiera de las dos células hijas, generando aneuploidía: una célula hija tendría cromosomas en exceso y la otra carecería de algunos cromosomas.
- Sintélica: ambas cromátidas están ancladas a MTs que emanan del mismo polo; esta situación tampoco genera tensión centromérica, y se activará el punto de control del huso. Si no se corrige, ambas cromátidas terminarán en la misma célula hija, generando aneuploidía.
- Merotélica: al menos una cromátida se ancla simultáneamente a MTs que emanan de ambos polos. Esta situación genera una tensión centromérica, por lo que no se activa el punto de control del huso. Si no se corrige, la cromátida unida a ambos polos permanecerá como un cromosoma rezagado en la anafase, y finalmente se romperá en dos fragmentos, repartidos entre las células hijas, generando aneuploidía.
- el correcto ensamblaje del huso mitótico;
- la unión de todos los cromosomas al huso mitótico de forma bipolar;
- la congresión de todos los cromosomas en la placa metafásica.
- Las quinesinas KinI reciben el nombre de «I» porque presentan un dominio motor interno, que utiliza el ATP para promover la despolimerización del polímero de tubulina, el microtúbulo. En los vertebrados, la kinesina KinI más importante que controla la dinámica del ensamblaje del extremo (+) es la MCAK. Sin embargo, parece que hay otras kinesinas implicadas.
- Hay dos grupos de +TIPs con funciones de cinetocoro.
- El primero incluye la proteína adenomatous polyposis coli (APC) y la proteína asociada EB1, que necesitan MTs para localizarse en los cinetocoros. Ambas proteínas son necesarias para la correcta segregación cromosómica. EB1 sólo se une a los MT en estado de polimerización, lo que sugiere que promueve la estabilización de los kMT durante esta fase.
- El segundo grupo de +TIPs incluye proteínas que pueden localizarse en los cinetocoros incluso en ausencia de MT. En este grupo hay dos proteínas que han sido ampliamente estudiadas: CLIP-170 y sus proteínas asociadas CLASPs (CLIP-associated proteins). El papel de CLIP-170 en los cinetocoros es desconocido, pero la expresión de un mutante dominante negativo produce un retraso en la prometafase, lo que sugiere que tiene un papel activo en la alineación del cromosoma. Las proteínas CLASPs son necesarias para la alineación de los cromosomas y el mantenimiento de un huso bipolar en Drosophila, humanos y levaduras.
- Se trata de un sistema de alineación de cromosomas y de mantenimiento del huso bipolar en Drosophila, humanos y levaduras.
Tanto la configuración monotélica como la sintélica no generan tensión centromérica y son detectadas por el punto de control del huso. En cambio, la configuración merotélica no es detectada por este mecanismo de control. Sin embargo, la mayoría de estos errores son detectados y corregidos antes de que la célula entre en anafase. Un factor clave en la corrección de estos errores de anclaje es el complejo pasajero cromosómico, que incluye la proteína quinasa Aurora B, su subunidad diana y activadora INCENP y otras dos subunidades, Survivin y Borealin/Dasra B (revisado por Adams y colaboradores en 2001). Las células en las que se ha abolido la función de este complejo mediante mutantes dominantes negativos, RNAi, microinyección de anticuerpos o utilizando fármacos selectivos, acumulan errores de anclaje cromosómico. Numerosos estudios han demostrado que Aurora B es necesaria para desestabilizar el anclaje incorrecto cinetocoro-MT, favoreciendo la generación de conexiones anfitélicas. El homólogo de Aurora B en la levadura (Ipl1p) fosforila algunas proteínas del cinetocoro, como la proteína constitutiva Ndc10p y miembros de los complejos Ndc80 y Dam1-DASH-DDD. La fosforilación de los componentes del complejo Ndc80 produce la desestabilización del anclaje de los kMTs. Se ha propuesto que la localización de Aurora B es importante para su función: al estar localizada en la región interna del cinetocoro (en la heterocromatina centromérica), cuando se establece la tensión centromérica los cinetocoros hermanos se separan, y Aurora B no puede alcanzar sus sustratos, por lo que los kMTs se estabilizan. Aurora B se sobreexpresa frecuentemente en varios tipos de cáncer, y actualmente es una diana para el desarrollo de fármacos anticancerígenos.
Activación del punto de control del husoEditar
El punto de control del huso, o SAC (por spindle assembly checkpoint), también conocido como punto de control mitótico, es un mecanismo celular responsable de la detección de:
Cuando un solo cromosoma (por el motivo que sea) se queda rezagado durante la congresión, la maquinaria del punto de control del huso genera un retraso en la progresión del ciclo celular: la célula se detiene, dando tiempo a que los mecanismos de reparación resuelvan el problema detectado. Transcurrido un tiempo, si el problema no se ha resuelto, la célula será objeto de apoptosis (muerte celular programada), un mecanismo de seguridad para evitar la generación de aneuploidía, situación que generalmente tiene consecuencias dramáticas para el organismo.
Mientras que las proteínas centroméricas estructurales (como CENP-B), permanecen localizadas de forma estable a lo largo de la mitosis (incluso durante la telofase), los componentes del punto de control del huso se ensamblan en el cinetocoro en altas concentraciones en ausencia de microtúbulos, y sus concentraciones disminuyen a medida que aumenta el número de microtúbulos unidos al cinetocoro.
En la metafase, los niveles de CENP-E, Bub3 y Bub1 disminuyen de 3 a 4 veces en comparación con los niveles en los cinetocoros no unidos, mientras que los niveles de dineína/dinactina, Mad1, Mad2 y BubR1 disminuyen >10-100 veces. Así, en la metafase, cuando todos los cromosomas están alineados en la placa metafásica, todas las proteínas del punto de control se liberan del cinetocoro. La desaparición de las proteínas de punto de control fuera de los cinetocoros indica el momento en que el cromosoma ha alcanzado la placa de metafase y está bajo tensión bipolar. En este momento, las proteínas de punto de control que se unen e inhiben a Cdc20 (Mad1-Mad2 y BubR1), liberan a Cdc20, que se une y activa a APC/CCdc20, y este complejo desencadena la separación de las cromátidas hermanas y, en consecuencia, la entrada en anafase.
Varios estudios indican que el complejo Ndc80 participa en la regulación de la asociación estable de Mad1-Mad2 y dineína con los cinetocoros. Sin embargo, las proteínas asociadas al cinetocoro CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H y BubR1 son independientes de Ndc80/Hec1. La prolongada detención en prometafase observada en células con bajos niveles de Ndc80/Hec1 depende de Mad2, aunque estas células muestran bajos niveles de Mad1, Mad2 y dineína en los cinetocoros (<10-15% en relación con los cinetocoros no unidos). Sin embargo, si se reducen los niveles de Ndc80/Hec1 y Nuf2, Mad1 y Mad2 desaparecen completamente de los cinetocoros y el punto de control del huso se inactiva.
Las shugoshinas (Sgo1, MEI-S332 en Drosophila melanogaster) son proteínas centroméricas esenciales para mantener la cohesina unida a los centrómeros hasta la anafase. El homólogo humano, hsSgo1, se asocia a los centrómeros durante la profase y desaparece cuando comienza la anafase. Cuando los niveles de Shugoshin se reducen mediante ARNi en células HeLa, la cohesina no puede permanecer en los centrómeros durante la mitosis y, en consecuencia, las cromátidas hermanas se separan sincrónicamente antes de que se inicie la anafase, lo que desencadena una larga detención mitótica.
Por otro lado, Dasso y colaboradores han descubierto que las proteínas implicadas en el ciclo de Ran pueden detectarse en los cinetocoros durante la mitosis: RanGAP1 (una proteína activadora de GTPasas que estimula la conversión de Ran-GTP en Ran-GDP) y la proteína de unión a Ran llamada RanBP2/Nup358. Durante la interfase, estas proteínas se localizan en los poros nucleares y participan en el transporte núcleo-citoplasma. La localización en el cinetocoro de estas proteínas parece ser funcionalmente significativa, ya que algunos tratamientos que aumentan los niveles de Ran-GTP inhiben la liberación en el cinetocoro de Bub1, Bub3, Mad2 y CENP-E.
Orc2 (una proteína que pertenece al complejo de reconocimiento del origen -ORC- implicado en el inicio de la replicación del ADN durante la fase S) también se localiza en los cinetocoros durante la mitosis en células humanas; de acuerdo con esta localización, algunos estudios indican que Orc2 en levadura está implicado en la cohesión de las cromátidas hermanas, y cuando se elimina de la célula, se produce la activación del punto de control del huso. También se ha descubierto que algunos otros componentes de ORC (como orc5 en S. pombe) participan en la cohesión. Sin embargo, las proteínas ORC parecen participar en una vía molecular que es aditiva a la vía de la cohesina, y es mayormente desconocida.
Generación de fuerza para impulsar el movimiento del cromosomaEditar
La mayoría de los movimientos de los cromosomas en relación con los polos del huso están asociados al alargamiento y acortamiento de los kMT. Una de las características más interesantes de los cinetocoros es su capacidad para modificar el estado de sus kMTs asociados (alrededor de 20) desde un estado de despolimerización en su extremo (+) a un estado de polimerización. Esto permite que los cinetocoros de las células en prometafase muestren «inestabilidad direccional», cambiando entre fases persistentes de movimiento hacia el polo (poleward) o inverso (antipoleward), que se acoplan con estados alternos de despolimerización y polimerización de los kMTs, respectivamente. Esta biestabilidad del cinetocoro parece formar parte de un mecanismo para alinear los cromosomas en el ecuador del huso sin perder la conexión mecánica entre los cinetocoros y los polos del huso. Se cree que la biestabilidad del cinetocoro se basa en la inestabilidad dinámica del extremo de los kMT (+), y está parcialmente controlada por la tensión presente en el cinetocoro. En las células cultivadas de mamíferos, una tensión baja en los cinetocoros promueve el cambio hacia la despolimerización de los kMTs, y una tensión alta promueve el cambio hacia la polimerización de los kMTs.
Las proteínas del cinetocoro y las proteínas que se unen al extremo (+) de los MTs (denominadas colectivamente +TIPs) regulan el movimiento del cinetocoro a través de la regulación de la dinámica del extremo (+) de los kMTs. Sin embargo, la interfaz cinetocoro-microtúbulos es altamente dinámica, y algunas de estas proteínas parecen ser componentes de buena fe de ambas estructuras. Dos grupos de proteínas parecen ser especialmente importantes: las quinesinas que funcionan como despolimerasas, como las quinesinas KinI; y las proteínas unidas a los extremos (+) del MT, las +TIP, que promueven la polimerización, quizás antagonizando el efecto de las despolimerasas.