VI. Creación del esfínter pilórico
Los estudios sobre el desarrollo del esfínter pilórico se han concentrado principalmente en modelos murinos y aviares. El estómago del ratón presenta la típica morfología del intestino anterior de los mamíferos, en el que el cuerpo que contiene células parietales es anterior a un antro que segrega moco. En el pollito, sin embargo, el proventrículo es la región glandular anterior. Una molleja muscular funcionalmente única forma el estómago posterior, pero expresa muchos de los mismos marcadores genéticos que el antro de los mamíferos.82-84 La región pilórica del pollo tiene un epitelio único, que difiere del de la molleja circundante o del intestino. Sin embargo, en el ratón, no hay diferencias morfológicas notables en el epitelio que separa el antro del píloro. A pesar de estas evidentes variaciones en la morfología del tracto gastrointestinal, la red genética del desarrollo del píloro y del estómago distal parece estar bien conservada entre las dos especies.82
Uno de los primeros marcadores del territorio pilórico es Nkx2-5. La expresión de este gen homeobox se observa por primera vez en las condensaciones bilaterales de la placa mesodérmica esplácnica en E9.5.21 Para E10.5, la expresión de Nkx2-5 demarca claramente un anillo de mesodermo justo distal al estómago, en el lugar del futuro píloro. La expresión de Nkx2-5 en esta unión entre el intestino y el estómago se observa en aves, ratones, ranas adultas y renacuajos (a pesar de que los renacuajos tienen un estómago mal delimitado y no tienen esfínter pilórico).82 Aunque el dominio de la tinción de Nkx2-5 es ligeramente más amplio en los renacuajos en comparación con las ranas adultas (se expande ligeramente en la parte anterior), el hecho de que este marcador se exprese, incluso en ausencia de un esfínter pilórico, sugiere que Nkx2-5 puede estar desempeñando funciones de patrón independientes de su posible papel en el desarrollo del esfínter per se. Dado que los embriones de ratón nulos para Nkx2-5 mueren muy pronto por defectos cardíacos,85 el análisis de su participación en la morfogénesis del esfínter o en el patronaje en general tendrá que ser analizado utilizando un enfoque condicional.
En el pollito, el dominio de expresión de Nkx2-5 se localiza en el píloro y se solapa con el dominio para los receptores Bmp, Bmpr1b y Bmpr1a.83 Bmp4, uno de los ligandos de estos receptores, está excluido de la molleja y el píloro, pero se expresa en el mesodermo intestinal adyacente. La expresión ectópica de Bmp4 o de sus receptores en la molleja amplía el dominio de expresión de Nkx2-583 mientras que la expresión ectópica de noggin lo reduce.83,84 Además, la sobreexpresión de los receptores Bmp activa Nkx2-5 de forma autónoma. La expresión ectópica de Bmp4 también cambia el carácter del epitelio de la molleja para asemejarse al de la región pilórica.84 Curiosamente, esto ocurre sin cambios en la expresión de los marcadores estomacales (Sox2 y Barx1), los marcadores intestinales (CdxA y Nkx2.3) o los marcadores de toda la región (Pdx1). Por lo tanto, estos primeros estudios sugirieron que Bmp4 (que se encuentra aguas abajo de las señales Shh del endodermo) es directamente responsable del patrón de expresión de Nkx2-5 en el píloro y que Nkx2-5 puede, a su vez, activar señales que se dirigen al epitelio para determinar su carácter.
Además de su activación de Nkx2-5, la actividad de la vía de BMP también activa la expresión de Sox9 en el mesénquima pilórico de forma autónoma a las células.83,86 Curiosamente, la expresión errónea de Nkx2-5 no afecta a la expresión de Sox9 (y viceversa), lo que sugiere vías independientes para la activación de cada uno de estos factores por parte de las BMP.86,87 El endodermo de la molleja del pollo puede convertirse en epitelio de tipo pilórico mediante la expresión errónea de formas dominantes negativas de Nkx2-5 (enrepNkx2-5) o Sox9 (Sox9DCter), aunque la conversión epitelial por enrepNkx2-5 de esta manera es incompleta,83,87 lo que sugiere que Nkx2-5 no es suficiente para especificar la región pilórica. Curiosamente, la expresión errónea de Gremlin en el mesodermo de la molleja produce un fenotipo epitelial similar al de la expresión errónea de Bmp4, Bmpr1b, Nkx2-5 o Sox9, lo que sugiere que Nkx2-5 y/o Sox9 pueden especificar el epitelio pilórico indirectamente a través de la regulación de la expresión de Gremlin.87 En apoyo de esta hipótesis, la expresión errónea de Sox9 o Sox9DCter en el mesodermo del estómago expande o reduce la expresión de Gremlin, respectivamente. Puesto que Nkx2-5 no regula Sox9 y la relación reguladora entre Nkx2-5 y Gremlin no está clara, el mecanismo por el que Nkx2-5 controla el fenotipo epitelial pilórico sigue sin resolverse.
Otra molécula que se sabe que es importante para el desarrollo del píloro es Barx1, mencionada anteriormente como una proteína de dominio homeobox que se activa en el mesénquima bajo las lesiones positivas de Sox2 en las células Cdx2-nulas. En el ratón, Barx1 se expresa en todo el mesénquima estomacal del embrión temprano, pero está ausente del estómago en el neonato y el adulto.26,33 En los animales neonatales sin Barx1 (que deben ser generados en un fondo mixto para sobrevivir más allá de E12), la expresión de Cdx2 se expande en sentido anterior, aunque se sigue observando un límite de expresión anterior muy marcado de la expresión de Cdx2.26Pdx1 también se expande, de manera que su límite anterior colinda con el estómago escamoso, como si el corpus estuviera ausente o truncado. El esfínter pilórico falta por completo en los animales nulos de Barx1 y, como se ha comentado anteriormente, se ha planteado la hipótesis de que esto se debe a un aumento de la señalización Wnt en el estómago tras la inducción de los inhibidores de Wnt Sfrp1 y Sfrp2.33
Barx1 también es necesaria para la morfogénesis del bazo, pero en este caso, su papel no implica el antagonismo de la señalización Wnt.26 Más bien, la pérdida de Barx1 reduce la expresión de Wt1 en el bazo. Wt1 se expresa en el mesotelio y en el mesénquima del bazo y su pérdida, al igual que la de Barx1, da lugar a un bazo más pequeño que no está bien separado del páncreas. Sin embargo, a diferencia de la situación en los ratones nulos para Bapx1 descrita anteriormente, esta asociación continua con el páncreas en los animales nulos para Barx1 no da lugar a crecimientos metaplásicos en el páncreas.26 Dado que estas lesiones metaplásicas pueden producirse en asociaciones de tipo salvaje de bazo y páncreas in vitro, parece poco probable que dependan de algún aspecto único del fenotipo Bapx1-nulo y más bien que los animales Barx1-nulos carezcan de ciertas señales que permitan el desarrollo de dichas estructuras.
Al igual que Barx1 y Nkx2-5, Bapx1 (Nkx2-3) es un actor crítico tanto en la morfogénesis esplénica como en la pilórica. Bapx1 se activa ligeramente más tarde que Barx1 y Nkx2-5 y en el pollito, se observa primero en el mesodermo lateral izquierdo y más tarde en la presunta molleja donde se concentra progresivamente adyacente al píloro.88 En embriones de pollito, la expresión ectópica de Bapx1 inhibe la expresión de Bmp4 y Wnt5a en el proventrículo y convierte el epitelio y el mesénquima del proventrículo en una morfología similar a la de la molleja.88 Por lo tanto, se postula que Bapx1 en la molleja actúa para suprimir Bmp4 y Wnt5a en esta región y, de hecho, la expresión de una forma de Bapx1 que está vinculada al represor engrailed da lugar a la activación ectópica de Bmp4 y Wnt5a en la molleja. También se observa una conversión parcial del proventrículo en la molleja cuando se expresa una forma dominante-negativa de Nkx2-5 en el proventrículo, pero la expresión de Bmp4 y Wnt5a no se altera en este caso.83 Además, la Bapx1 ectópica no afecta a la expresión de Nkx2-5, Barx1 o Pdx1, lo que sugiere que no se encuentra aguas arriba de estos factores.88
En el ratón, Bapx1 se expresa en el antro en E10.5, con un borde anterior nítido en la unión entre el antro y el corpus; más tarde, su expresión se expande para incluir la mayor parte del estómago, aunque la expresión es a un nivel bajo. La interrupción dirigida de Bapx1 provoca la pérdida de la constricción pilórica (malformación del esfínter pilórico) y el acortamiento del antro,27 pero no interrumpe la expresión de Nkx2-5. Verzi y sus colegas investigaron ratones doblemente nulos para Bapx1 y Barx1 y descubrieron que el fenotipo se asemeja al del animal nulo para Barx1; la porción del corpus está más truncada en los animales nulos para Barx1 que en los nulos para Bapx1. Además, mientras que la expresión de Barx1 no estaba perturbada (o posiblemente aumentada) en los ratones Bapx1-/-, la expresión de Bapx1 estaba muy reducida en los animales nulos de Barx1, estableciendo que Barx1 es epistático a Bapx1 en el antro en desarrollo.27
El factor de transcripción homeobox Six2 también se localiza en el estómago posterior. En el ratón, Six2 se expresa desde E10.5 hasta E14.5, cuando su expresión se regula significativamente y su dominio de expresión se restringe a una región justo caudal al píloro.28Six2 también se expresa en el estómago posterior de la rana y el pollo, lo que indica que es probable que sea un componente clave del programa de señalización para esta región.82 Los mutantes de Six2 expresan ectópicamente Bmp4 en el píloro; por lo tanto, Six2 puede ser responsable (quizás junto con Bapx1) de la regulación a la baja de Bmp4 en esta región. Además, los animales nulos de Six2 muestran una reducción (pero no una extinción) de la expresión de Nkx2-5, Sox9 y Grem1, una expansión del dominio de Bmp4 en el mesodermo estomacal posterior y una pérdida de la constricción pilórica.28Six2, al igual que Nkx2-5, es uno de los primeros marcadores del presunto píloro; como tal, puede ser un importante impulsor de la morfogénesis pilórica, pero todavía no está claro cómo se vincula precisamente con este programa de desarrollo. Es curioso que en el ratón, la ausencia de Six2 permite la expresión ectópica de Bmp4, pero encoge el dominio de Nkx2-5 y Sox9.28 Esto es lo contrario de lo que se observa en el pollito, donde Bmp4 ectópico expande el dominio de ambos genes. Se necesitan estudios adicionales para entender estas diferentes respuestas. La figura 5 resume las interacciones reguladoras que caracterizan el desarrollo del píloro.
Fig. 5. Resumen simplificado de las interacciones reguladoras de los genes que caracterizan el desarrollo del mesénquima pilórico. Los genes epiteliales están representados por encima de la línea, mientras que los genes mesenquimales están por debajo de la línea. Los asteriscos indican los factores que han demostrado ser necesarios para el desarrollo de la constricción pilórica. Ver texto para más detalles.