Guinguette Marais Poitevin

METODOS

Se trata de un estudio transversal realizado para la evaluación del estado de secreción y no secreción del HBA en la población de Karachi (Pakistán). Ciento un estudiantes adultos sanos (76 hombres, 25 mujeres) de entre 15 y 40 años de edad fueron seleccionados al azar para este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los individuos. Este estudio fue aprobado por el comité ético de la Universidad Médica Baqai de Karachi. Se recogieron diez ml de saliva en recipientes de plástico desechables esterilizados de todos los individuos. Se recogieron cinco ml (2 ml en un tubo con EDTA y 3 ml en un tubo sin anticoagular) de sangre de todos los individuos de forma aséptica para la determinación del grupo celular y del suero.

Procedimiento de determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh:

Preparación de una suspensión de glóbulos rojos al 3%: Dos ml de sangre recogida en un tubo anticoagulado con EDTA se centrifugó a baja velocidad (1500 rpm) durante 3 minutos. El plasma se transfirió a otro tubo y se utilizó en la agrupación del suero. El tubo que contenía las células se llenó con solución salina normal. El tubo se mezcló bien y se volvió a centrifugar a 1500 rpm durante 3 minutos. El procedimiento de lavado se repitió dos veces. Durante el último lavado, el tubo se centrifugó a alta velocidad (3000rpm) durante 3 minutos y se descartó el sobrenadante. Un sobrenadante transparente y la aparición de una línea de arrastre celular indican un lavado celular correcto.

I: Agrupación de células: Se etiquetaron tres tubos de ensayo de vidrio limpios como tubo A para anti A, tubo B para anti B y tubo D para anti D. Se añadió una gota de antisuero como suero anti A al tubo A, suero anti B al tubo B y suero anti D al tubo D. Se añadió una gota de suspensión de eritrocitos al 3% al tubo A, al tubo B y al tubo D. Todo el contenido se mezcló bien. Todos los tubos se centrifugaron inmediatamente equilibrando a 3400 rpm durante 15 segundos. Todos los tubos se sacaron suavemente y se examinaron individualmente para comprobar la aglutinación.

II: Agrupación del suero: El suero se separó del tubo no anticoagulado después de centrifugarlo durante 5 minutos a 3000rmp. Se etiquetaron tres tubos de ensayo de vidrio limpios como tubo «a» para las células A, tubo «b» para las células B y «o» para las células O. Se añadieron dos gotas de suero individual a cada tubo. Se añadió una gota de suspensión de glóbulos rojos conocida al 3% de células A, B y O al tubo «a», «b» y «o». El contenido de todos los tubos se mezcló bien y se centró inmediatamente durante 15 segundos. Todos los tubos se sacaron suavemente y se examinaron individualmente para comprobar la aglutinación.

Todas las muestras se analizaron en un plazo de 6 horas, utilizando una suspensión de glóbulos rojos fresca del mismo individuo. Recogida y procesamiento de la saliva: Se recogieron 10 ml de saliva de todos los individuos en un recipiente de plástico desechable esterilizado y se transfirieron del recipiente a un tubo de vidrio desechable esterilizado. El tubo que contenía la saliva se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de vidrio. El tubo que contenía el sobrenadante de saliva se colocó en un baño de agua a 56oC durante 30 minutos para inactivar la amilasa salival. El tubo de la muestra se enfrió y se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 2000 rpm. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de ensayo desechable y se utilizó para la prueba de inhibición de la hemaglutinación o de neutralización.

Principio de la prueba de inhibición de la hemaglutinación: Las sustancias ABH presentes en forma soluble en los fluidos (por ejemplo, la saliva) neutralizan sus correspondientes anticuerpos. Los anticuerpos ya no podrán aglutinar glóbulos rojos que posean los mismos antígenos.11,12

Procedimiento de la prueba de inhibición de la hemaglutinación:

Preparación de las diluciones de duplicación de antisueros del grupo sanguíneo: Se colocaron diez tubos de ensayo en una gradilla etiquetada según el título, es decir, 1:2 (tubo1), 1:4 (tubo 2), hasta 1:1024 (tubo10). Se añadieron 200 microlitros de solución salina a todos los tubos. En el tubo 1 se añadieron 200 µl de antisueros y se mezclaron bien. Se transfirieron doscientos µl de las diluciones del tubo 1 al tubo 2 y se mezclaron bien. Se repitió el mismo procedimiento del tubo 2 al tubo 10. Se descartaron 200 µl de antisueros diluidos del tubo10. Cada tubo contenía igual cantidad de antisueros y solución salina. Esta solución de dilución doble se utilizó en la prueba de inhibición de la aglutinación del hemisferio.

Se colocaron tres filas de 10 tubos de ensayo en una gradilla y se etiquetaron como; I: Tubos de dilución doble (D/D) II: Tubos de control (tubos de titulación) III: Tubos de ensayo (tubos de inhibición).

En la fila I se preparó una dilución doble de antisueros específicos de grupo. Cada tubo se etiquetó según el título, es decir, 1:2 (tubo1), 1:4 (tubo2) hasta 1:1024 (tubo10). Cien µl de antisueros específicos del grupo sanguíneo de cada dilución se transfirieron a los tubos etiquetados correspondientes en las filas II y III como se muestra en la Tabla-I. Se añadieron cien µl de solución salina a cada tubo de la fila II. Se añadieron cien µl de saliva a cada tubo de la fila III. Se taparon todos los tubos de las filas II y III y se mezclaron bien. Estos tubos se incubaron a 37°C durante 30 minutos en un baño de agua con agitación periódica. Tras la incubación, se añadieron 100 µl de suspensiones de glóbulos rojos específicos de grupo al 3% a cada tubo de las filas II y III y se mezclaron bien. Todos los tubos se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Todos los tubos fueron observados para la aglutinación macroscópica bajo una buena fuente de luz.

Interpretación de los resultados:

• Estado de secretor positivo:

La aglutinación macroscópica a un título más alto (1:128) en el control (fila II) y a un título más bajo (1:16) en la prueba (fila III) indicó la presencia de sustancias del grupo sanguíneo en la saliva de la prueba.

• Estado de secretor negativo:

Ninguna diferencia en el título al que se produjo aglutinación visible en ambas filas implicó la ausencia de sustancias específicas del grupo sanguíneo en la saliva para neutralizar el antisuero.13

Análisis estadístico: Para el análisis de los datos se utilizó el paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS) versión 17. Se utilizó la estadística descriptiva para el cálculo de frecuencias y porcentajes.