Vías de (bio)degradación de los explosivos nitroaromáticos
El TNT, que tiene un Θzz positivo, sufre principalmente (bio)transformaciones reductoras nucleofílicas debido al carácter electrófilo del núcleo aromático y del átomo N del grupo nitro (Stenuit y Agathos, 2010). El fraccionamiento de isótopos de C, N y H de los compuestos nitroaromáticos en los materiales del subsuelo confirmó que el TNT sufre principalmente una transformación reductora, mientras que la transformación del 2,4-DNT, que se caracteriza por una mayor densidad de electrones que el TNT, se debe principalmente a la oxigenación (Wijker et al., 2013).
En consecuencia, el TNT se reduce fácilmente a derivados aromáticos nitrosos, hidroxilaminos y, en última instancia, aminos, mediante tres transferencias sucesivas de un par de electrones (Stenuit y Agathos, 2010). El paso inicial de nitrorreducción de cuatro electrones es catalizado por nitrorreductasas típicas dependientes de NAD(P)H e insensibles al oxígeno (tipo I) (Stenuit y Agathos, 2010) y transferencias de hidruros de tipo I y II de la familia Old Yellow Enzyme (OYE) (van Dillewijn et al., 2008). Se ha sugerido que otras enzimas pueden participar además en el último paso de nitrorreducción de dos electrones para formar el aminoareno (Riefler y Smets, 2002).
Además, el TNT no está sujeto al ataque electrofílico convencional de las oxigenasas. Por el contrario, el TNT es propenso al ataque nucleofílico impulsado por superóxidos, como se observó con el sistema biomimético que contiene nucleótidos de piridina reducidos y piocianina, un metabolito redox-activo secretado por Pseudomonas aeruginosa (Stenuit et al., 2009, Stenuit et al., 2012). Además, los σ-aductos aniónicos del TNT, también denominados complejos de TNT Meisenheimer, se producen fácilmente por la formación de enlaces covalentes entre nucleófilos, como la forma cargada negativamente del átomo de hidrógeno, H- (ion hidruro), y el anillo aromático del TNT. Hasta ahora, se han caracterizado varias enzimas de bacterias y plantas que catalizan la adición nucleófila de iones hidruro al anillo aromático del TNT, entre las que se incluyen las transferencias de hidruro OYE de tipo II específicas dependientes de NAD(P)H (Figura 3(a)) (Beynon et al., 2009, Durchschein et al., 2013) y, en mucho menor medida, las transferencias de hidruros actinomicetales específicas dependientes de F420 (Heiss y Knackmuss, 2002). Tras la transferencia de iones de hidruro al anillo aromático del TNT, se producen complejos de hidruro y dihidruro de Meisenheimer del TNT (-TNT y -TNT, respectivamente) y pueden producir además nitrito y diversos metabolitos desnitrados del TNT que suelen acumularse en el medio de reacción. Por lo tanto, aunque el nitrógeno del TNT pueda ser asimilado a través de la actividad de la nitrito reductasa y de la vía de la glutamina sintasa-glutamato sintasa (GS-GOGAT), se ha observado comúnmente que los metabolitos desnitrados del TNT no pueden ser utilizados como fuente de carbono. El problema inherente a la amplia desviación química y metabólica impide la aparición de una única vía de biodegradación beneficiosa para el TNT. Por ejemplo, los productos de condensación de los metabolitos del TNT pueden producirse entre (i) isómeros de nitroso e hidroxilamino-dinitrotolueno para formar compuestos de tetranitroazoxytolueno como el 4,4′,6,6′-tetranitro-2,2′-azoxytolueno y (ii) isómeros de hidroxilamino-dinitrotolueno y complejos de Meisenheimer de dihidruro protonado del TNT para formar diarilaminas secundarias (van Dillewijn et al., 2008). Los metabolitos del TNT derivados de la reducción de la fracción de nitro también pueden sufrir la oxidación de la fracción de metilo o la acetilación de la fracción de amino (Stenuit y Agathos, 2010). Estos diversos compuestos se denominan comúnmente metabolitos suicidas porque se acumulan. Además, la formación de metabolitos suicidas debido a los efectos tóxicos de los productos intermedios y secundarios que se generan por la reducción del nitro-moiety parece ser una barrera importante para un metabolismo productivo del TNT (Lenke et al., 2000).
Figura 3. Biodegradación de nitroexplosivos catalizada por (a) algunos miembros de la familia OYE (ej, PETN reductasa), (b) las reductasas dependientes de F420 del grupo npd, y (c) el sistema XplA-XplB.
Aprovechando las capacidades catabólicas de las levaduras Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum y la acidificación del medio de cultivo mediante la producción de ácidos orgánicos, Ziganshin et al. (2010a,b) han informado de la transformación en condiciones ácidas (es decir, a un pH < 4,2) de C3–TNT a 2,4-DNT, un metabolito mineralizable TNT-denitrado (Johnson et al., 2002), con la liberación concomitante de nitrito.
Usando DNA-SIP y T-RFLP, Gallagher et al. (2010) han reportado la utilización de TNT como fuentes de carbono y nitrógeno bajo condiciones sulfogénicas por una cepa de Lysobacter taiwanensis inicialmente presente en sedimentos estuarinos anaeróbicos ricos en materia orgánica. Sin embargo, la incorporación de TNT en la biomasa celular de Lysobacter como sustrato primario o como co-sustrato (cometabolismo) aún está por dilucidar. Aunque son necesarios experimentos adicionales en cultivos axénicos para descifrar las vías completas de biodegradación catalizadas por L. taiwanensis, la demostración inequívoca de la asimilación bacteriana anaeróbica tanto del N como del C del TNT ofrece nuevas y prometedoras posibilidades de remediación, como los ensayos de bioaumentación de entornos anaeróbicos contaminados con TNT.
Aunque las vías de biodegradación del TNT de las que se informa en la literatura se apoyan exclusivamente en el cometabolismo, se ha informado de que algunas bacterias específicas del orden Actinomycetales utilizan el TNP como única fuente de nitrógeno, carbono y energía sin reducción de la fracción nitro (p. ej, ácido picrámico, un derivado monoamino del TNP) (Hofmann et al., 2004). La principal vía catabólica del TNP es la transferencia enzimática de hidruros al núcleo aromático, seguida de sucesivas reacciones de desnitrificación y la canalización de los metabolitos escindidos hacia el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Se ha caracterizado el clúster de genes de degradación del TNP (clúster npd), con la identificación de diferentes inductores y del regulador transcripcional NpdR (Nga et al., 2004). Las enzimas implicadas en las vías catabólicas periféricas de TNP en Rhodococcus opacus HL PM-1 son la hidruro transferasa II (HTII), codificada por npdI, y la hidruro transferasa I (HTI), codificada por npdC, que producen el complejo monohidruro de Meisenheimer de TNP (-TNP) y el complejo dihidruro de Meisenheimer de TNP (-TNP) (Nga et al., 2004), respectivamente. La actividad de HTII y HTI depende de una F420 reductasa dependiente de NADPH (NdfR), codificada por npdG, que actúa como un transportador de electrones entre NADPH y F420. Como se muestra en la Figura 3(b), la transferencia de hidruro desde la coenzima reducida F420H2 al anillo aromático de TNP es catalizada por HTII/HTI (Nga et al., 2004). En Nocardioides simplex FJ2-1A, se producen las mismas vías catabólicas periféricas de la TNP, excepto que una única hidruro transferasa (HT) cataliza la producción de -TNP y -TNP (Hofmann et al., 2004). Posteriormente, la tautomerasa NpdH, codificada por npdH, cataliza un tautomerismo de cambio de protones del -TNP para producir la forma nitro (R2C(- H)NO2) y la forma aci-nitro (R2C=N+(- O-)OH) en equilibrio. Esta última se somete a una reacción de desnitrificación enzimática catalizada por extractos libres de células de R. opacus HL PM-1 o N. simplex FJ2-1A (que contiene una desnitrasa huérfana) para formar el complejo monohidruro de Meisenheimer del 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) (Hofmann et al., 2004). Tras una segunda hidrogenación por el sistema HTI-NdfR (o HT-NdfR), el intermedio dihidrido se protoniza a pH 7,5 para formar 2,4-dinitrociclohexanona, que se somete a una escisión catalizada por la hidrolasa a 4,6-dinitrohexanoato. Debido a que este último puede ser finalmente canalizado hacia el ciclo del TCA, la biodegradación del TNP es autosostenible y puede proporcionar, en sitios contaminados por altas concentraciones de TNP, ventajas selectivas a los microorganismos degradadores.
Para la biodegradación del análogo del TNT, el tetril, se reconoce que su hidrólisis puede producir TNP, que puede someterse a una completa biodegradación microbiana (Lewis et al., 2004). También se ha observado la N-denitración enzimática del tetril en condiciones anaeróbicas con la formación de N-metil-2,4,6-trinitroanilina (Myers y Spinnato, 2007), un compuesto trinitroaromático para el que es necesario realizar experimentos de biodegradabilidad.
En conclusión, ningún microbio por sí solo lleva a cabo suficientes reacciones para obtener un beneficio de la biodegradación del TNT (Copley, 2009). La aparición de una vía de mineralización puede ser más rápida cuando se encuentran varias reacciones consecutivas en un solo microbio. Aunque se ha informado de una eliminación de nitrito catalizada por una dioxigenasa como reacción inicial para el 2,6-DNP (Ecker et al., 1992), hasta ahora no se ha descrito el ataque electrofílico del 2,4-DNP debido al efecto inductor negativo del grupo hidroxilo y al impedimento estérico específico. Por lo tanto, la hidrogenación inicial del sistema de anillos aromáticos se observa comúnmente para el 2,4-DNP y el TNP, de modo que su biodegradación es catalizada por la misma maquinaria enzimática en un solo microbio. Por el contrario, se han observado vías de biodegradación diferentes para los isómeros de TNT y DNT. De hecho, el 2,4-DNT y el 2,6-DNT se degradan completamente a través de una reacción inicial de dioxigenasa (Johnson et al., 2002). En consecuencia, los procesos sintróficos, por ejemplo, la desnitrificación reductora del TNT a 2,4-DNT seguida de la biotransformación oxidativa del 2,4-DNT, se han propuesto como una estrategia adecuada para obtener la mineralización del TNT (Tront y Hughes, 2005). Sin embargo, durante la desnitrificación del TNT se producen múltiples vías competitivas tanto en cultivos puros como mixtos y, como consecuencia, conducen a metabolitos desnitrificados sin salida en lugar de isómeros de DNT. En este contexto, la evidencia experimental de la producción de 2,4-DNT a partir de la biodegradación del TNT catalizada por cepas de levadura (Ziganshin et al., 2010a,b) puede ser de importancia primordial para implementar un proceso impulsado por la mineralización del TNT.