Diseño y métodos de investigación
Tecnología de monitor de glucosa no invasivo
La tecnología utilizada para el dispositivo de medición de glucosa se basa en el principio de que el cuerpo humano emite de forma natural una fuerte radiación electromagnética en la región de la longitud de onda micrométrica y en el descubrimiento de que dicha radiación contiene información espectral de los analitos de los tejidos. Aunque esta tecnología patentada tiene aplicaciones para medir los niveles de diversas sustancias en el cuerpo humano, el plan inicial es utilizarla en un monitor de BG debido a la importante necesidad no cubierta de sustituir los métodos actuales de medición.
El cuerpo humano emite una fuerte radiación electromagnética. Las leyes de la física establecen que todos los objetos emiten radiación IR y que la intensidad de la radiación y las características espectrales del objeto están determinadas por su temperatura absoluta, así como por las propiedades y estados del objeto.
La ley de Planck (19) describe una relación entre la intensidad radiante, la distribución espectral y la temperatura del cuerpo negro. El cuerpo humano es un excelente emisor de cuerpo negro de luz del infrarrojo medio precisamente en la región espectral adecuada. La característica espectral de la emisión térmica está influida por la composición tisular del individuo y las concentraciones de analitos. La ley de Kirchhoff confirma que para todo el cuerpo a la misma temperatura y para la misma longitud de onda, la absorbencia es igual a la emisividad monocromática.
Los sensores para la medición de analitos deben tener la sensibilidad y selectividad requeridas, esterilizabilidad y estabilidad a largo plazo. Los sensores espectroscópicos pueden cumplir todos estos requisitos. Entre las distintas regiones espectrales, la espectroscopia del infrarrojo medio ofrece una mayor sensibilidad y selectividad debido al contenido de información de la región de la huella digital. La selectividad de esta tecnología se basa en el mismo principio que la selectividad del método de espectroscopia de absorción para la medición de analitos. La glucosa tiene características espectrales muy bien definidas en la región IR de la huella dactilar, como se muestra (por ejemplo, en los estudios de Heise et al. y Vonach et al. y en nuestras parcelas de emisión térmica del plasma Fig. 2).
En una disposición experimental sencilla, se puede demostrar que la emisión de la glucosa puede detectarse utilizando detectores a temperatura ambiente en una configuración basada en filtros. Un espectrómetro basado en un filtro no dispersivo especialmente diseñado (Fig. 1) realizó mediciones de absorción y emisión. Un espectrómetro de filtro tiene la ventaja de la simplicidad, una alta relación señal-ruido, un alto rendimiento y un bajo coste. Las ruedas de filtro giratorias con curvas de transmisión características, cuando se colocan en la trayectoria de la luz, generan bandas de paso variable con baja resolución. Como filtro, se utilizó un filtro IR variable circular, segmento #3, fabricado por el Optical Coating Laboratory, con una banda de transmisión de 7,7 a 14,1 μm. La radiación IR fue recogida por una guía de ondas IR hecha de un tubo, con una superficie interior dorada, que dirigía la radiación IR hacia un filtro variable muy cercano. Al otro lado del filtro, se colocó un detector de termopila (Perkin Elmer/Heineman modelo TPS 434) en el eje óptico de la guía de ondas muy cerca de la superficie del filtro. La combinación del diámetro de la guía de ondas, el orificio de apertura del detector y la dimensión de su área sensible funcionaba como una rendija en la espectrometría estándar con <0,2-μm de resolución espectral. Se encontró información útil de datos espectrales en el rango de 9-13 μm, debido a la combinación del efecto de borde en los extremos del filtro y la resolución debida a la anchura de la rendija. Se promediaron al menos seis espectros y se utilizó el procedimiento de Fourier de suavizado de seis puntos para eliminar el ruido rápido del espectro. Tanto los espectros de transmisión como los de emisión (tras la corrección por la emisión térmica de fondo del instrumento) se dividieron por los valores de intensidad de radiación teórica del cuerpo negro, lo que dio lugar a valores proporcionales a la absortividad y la emisividad monocromática. Los cambios medidos en la emisividad monocromática estaban en el rango de 10-4, todavía por encima del límite de ruido del sistema. Como ejemplo, la Fig. 2A muestra los espectros de emisión IR térmica (a 41°C) de la glucosa en una pastilla de KBr (bromuro de potasio) con un espectro de transmitancia (curva inferior) para comparar. Incluso con estos espectros de baja calidad, se pueden observar las correspondientes bandas de absorción de la glucosa, por ejemplo, una banda principal a 9,6 μm, una banda a 10,9 μm (correspondiente al estado vibracional 914 cm-1 de la glucosa) y una banda más débil alrededor de 12 μm. Se puede observar una típica imagen especular entre los espectros de transmisión y emisión. El espectro IR de la glucosa pura señala las bandas espectrales fundamentales de la firma de la glucosa.
Se midieron las características de emisión IR térmica de diferentes concentraciones de glucosa en soluciones de agua y plasma humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se reportan tales mediciones. Los resultados de la emisión IR del plasma humano a 37°C se muestran en la Fig. 2B. Esta figura destaca dos características importantes: en primer lugar, muestra la región espectral de interés y, en segundo lugar, presenta una prueba experimental de la capacidad de detección de la emisión térmica de los detectores IR actuales a temperatura ambiente. La deconvolución muestra las bandas sensibles y no sensibles a los cambios de concentración de glucosa en el plasma humano. Para mayor claridad, los espectros están desplazados hacia arriba a lo largo del eje vertical. Los resultados de la deconvolución en la tabla insertada muestran los cambios de intensidad de los picos frente a la concentración de glucosa. Una vez más, se pueden observar en la emisión las bandas correspondientes de absorción de glucosa, por ejemplo, una banda principal a 9,8 μm, una banda a 10,9 μm (correspondiente al estado vibracional de 914 cm-1 de la glucosa), y una banda más débil alrededor de 11,9 μm.
La radiación térmica del cuerpo humano contiene información sobre las características espectrales del objeto y está determinada por la temperatura corporal absoluta, así como por las propiedades y estados de los tejidos corporales emisores. Por lo tanto, se puede concluir que las características espectrales de la sangre con diferentes contenidos de glucosa (u otros analitos) cambiarán la emisividad de la membrana timpánica y permitirán medir la concentración de glucosa en la sangre.
Se sabe que la membrana timpánica está en una posición excelente para medir la temperatura corporal porque comparte su suministro de sangre con el hipotálamo, el centro de regulación de la temperatura corporal central. Un termómetro timpánico mide la intensidad integral (en todas las longitudes de onda) de la radiación térmica IR. Un sensor insertado en el canal auditivo puede obtener una visión clara de la membrana y sus vasos sanguíneos para medir la cantidad de radiación IR que emite la membrana. Si se compara con la radiación teórica del cuerpo negro descrita por las leyes de Planck y Kirchhoff, esta radiación IR está modificada espectralmente por la composición del tejido. Así, la radiación IR tiene características espectrales de, por ejemplo, la sangre en la membrana timpánica.
En este instrumento se separaron las características espectrales de varios constituyentes de la sangre utilizando métodos de espectroscopia de química analítica. El instrumento se basa en el uso de filtros IR colocados delante de las ventanas del detector IR. Un filtro hace pasar la radiación a través de las bandas de emisión térmica con firmas de glucosa y se coloca en una de las ventanas del detector IR, mientras que la otra ventana del detector IR está cubierta por un filtro capaz de hacer pasar la radiación que no incluye las bandas de emisión características del analito en las longitudes de onda del rango de interés. Una comparación de la intensidad de la radiación entre las dos ventanas del detector (como se muestra en la Fig. 3) proporciona una medida que es proporcional a la concentración del analito y puede correlacionarse con la concentración de BG.
La Figura 3 muestra un diagrama simplificado del instrumento. El instrumento recibe ópticamente la radiación IR del objeto objetivo, como una membrana timpánica. El sistema de detección consiste en un conjunto de filtros IR ópticos y un detector de termopila sensible en la región IR de la radiación del cuerpo humano. Uno de los elementos de detección está cubierto por un filtro IR sensible a la firma IR de la glucosa, mientras que un filtro apropiado que no tiene bandas espectrales características del analito medido cubre la otra área de detección. En el diseño de nuestro prototipo, se utilizó un punto denominado cuasi-isbéstico a unos 8,5 μm para las mediciones de intensidad de emisión de referencia y 9,6 μm para las mediciones de la firma de glucosa. La radiación IR modificada espectralmente de la membrana timpánica ilumina ambas ventanas. La diferencia de la intensidad de la radiación entre las dos vías de radiación proporciona una medida proporcional a la concentración de analito.
Diseños de estudios clínicos
La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Connecticut aprobó el estudio, y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar. Se inscribieron un total de 5 mujeres y 26 hombres con diabetes que requieren insulina, con edades comprendidas entre los 18 y los 75 años. Dos sujetos inscritos fueron excluidos de las pruebas. Uno de ellos tenía un acceso venoso deficiente y el otro tenía una concentración de glucosa sérica >400 mg/dl al inicio del estudio y requería tratamiento médico. Las mediciones de glucosa emparejadas de los primeros 23 sujetos se utilizaron para calibrar la medición del monitor no invasivo de la concentración de glucosa en la membrana timpánica con la concentración de glucosa en suero de una vena antecubital. Esta calibración se comprobó posteriormente comparando las concentraciones de glucosa de la membrana timpánica con las concentraciones de glucosa en suero en seis sujetos.
En la mañana del estudio, los sujetos continuaron con su medicación habitual pero no tomaron insulina ni desayunaron. Se examinó el canal auditivo de cada sujeto para verificar que la membrana timpánica estaba limpia de cerumen. En cuatro sujetos, se utilizó la irrigación con agua caliente para eliminar el cerumen que ocluía la membrana timpánica. Se colocó una vía intravenosa en una vena antecubital y se mantuvo abierta con solución salina al 0,45%. A los 0 minutos y cada 10 minutos durante un total de 210-250 minutos, se extrajeron 3 ml de sangre para medir la concentración de glucosa en suero. Se realizó una medición de la concentración de glucosa en la membrana timpánica inmediatamente después de finalizar la flebotomía. Se administró la insulina de acción prolongada habitual del sujeto a los 0 min, un desayuno con dieta consistente en carbohidratos a los 30 min y el bolo de insulina habitual del paciente a los 90 min. Para los sujetos que no utilizaban normalmente un bolo de insulina, el médico supervisor determinó el bolo en un intento de normalizar la concentración de glucosa sérica al final del estudio. El médico supervisor conocía los resultados de las mediciones de glucosa sérica y realizaba las intervenciones clínicamente apropiadas para las concentraciones de glucosa sérica >400 mg/dl o <60 mg/dl. La temperatura ambiente se mantuvo entre 18 y 25°C. La temperatura oral del sujeto, la temperatura ambiente y la humedad ambiente se registraron a los 0 minutos y cada 30 minutos hasta el final del estudio. El rango de humedad relativa de la habitación durante los experimentos estuvo entre el 20 y el 60%. Las mediciones de la temperatura del oído IR se realizaron 2 min después de cada medición de la glucosa. La enfermera que realizaba las mediciones no conocía las concentraciones de glucosa en suero de la membrana timpánica.
Se utilizó un total de 432 puntos de datos emparejados de 20 sujetos para la calibración de la concentración de glucosa de la membrana timpánica con la concentración de glucosa en suero. Una enfermera entrenada realizó las mediciones de la concentración de glucosa en la membrana timpánica para 19 de estos sujetos. Cuatro sujetos fueron entrenados y realizaron las mediciones de concentración de glucosa en la membrana timpánica por sí mismos. Se disponía de dos monitores para su uso. En el modo de calibración, se utilizó el monitor principal para 16 sujetos. El monitor de reserva se utilizó para cuatro sujetos.
Los resultados de tres sujetos no se incluyeron en el análisis de calibración. Los resultados de un sujeto que realizó sus propias mediciones y de otros dos sujetos (con mediciones realizadas por una enfermera) se rechazaron porque las lecturas no cumplían los criterios establecidos para la aceptabilidad de los datos de los instrumentos no invasivos (ver métodos de análisis de datos). Se utilizó el monitor primario para estos tres sujetos. Tras la calibración del dispositivo no invasivo, el protocolo del estudio se realizó de forma prospectiva y ciega en seis sujetos, todos ellos utilizando el monitor primario. El observador que informaba de la concentración de glucosa en la membrana timpánica y el observador que recibía el informe de la concentración de glucosa en suero no conocían los resultados de la medición complementaria. Todos los puntos de datos informados se incluyeron en el análisis de datos de los seis sujetos estudiados prospectivamente.
Métodos de análisis de datos
Los estudios del monitor de glucosa no invasivo se dividieron en dos partes. En la primera parte, se calibró el monitor mediante un modelo de regresión no lineal con los datos del primer grupo de sujetos. En la segunda parte, se realizaron los estudios prospectivos para la validación de la calibración y el método utilizado.
En la primera parte del experimento, el observador que informaba de la concentración de glucosa en la membrana timpánica tenía acceso a las mediciones invasivas y no invasivas. Se recogieron los datos de 23 sujetos (511 puntos de datos emparejados) para la calibración del monitor. Durante el análisis de los datos de calibración, se encontró que para tres sujetos, >50% de las mediciones (se realizaron 22-25 mediciones en un solo sujeto) tenían un error de instrumento en comparación con ninguno o menos errores para otros sujetos. El error del instrumento se indicaba si una señal del detector del monitor no era suave (el valor interno de una señal del detector cambia >20% para algunos de los 60 puntos de datos medidos subsiguientes por cada inserción del monitor en el canal auditivo del sujeto) o la señal del detector estaba fuera del rango definido en la dependencia de la temperatura ambiente y la humedad ambiental. El grupo de errores de estos tres sujetos sugería un error fundamental debido a la medicina (por ejemplo, una posible interferencia espectral de otros analitos que requerirá estudios especialmente diseñados o un canal auditivo no recto o bien enderezado) o al procedimiento de medición (el canal auditivo no estaba bien sellado por la punta de medición del instrumento, la punta de medición no estaba colocada a lo largo del canal auditivo y el eje de la membrana timpánica, o se produjo un error de técnica del operador en el manejo de las mediciones). Estos tres sujetos fueron eliminados como datos de entrada para la calibración. Para la calibración final, se utilizaron 20 sujetos (un total de 432 puntos de datos emparejados sin errores del instrumento), con un error del instrumento indicado para 13 puntos de datos (2,9% de 445 puntos totales). Basándose en los resultados de la calibración, un estadístico del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut realizó un análisis de potencia de los datos anteriores, e indicó que se necesitan de cuatro a seis sujetos para producir un modo de predicción de las mediciones para la validación de la calibración del monitor de glucosa no invasivo.
En la segunda parte del experimento, se realizaron mediciones totalmente predictivas. El observador que informaba de la concentración de glucosa en la membrana timpánica no conocía los resultados de las concentraciones de glucosa en suero del laboratorio. Las estimaciones por métodos invasivos y no invasivos se realizaron de forma independiente. En los seis sujetos, el instrumento indicó cuatro errores de medición (3,1% de un total de 130 puntos de datos emparejados). Una vez realizada y comunicada una estimación, no se descartó ningún punto. Esta segunda parte tenía como objetivo demostrar la reproducibilidad de la metodología una vez establecida la calibración del monitor de glucosa.
Se realizó un análisis estadístico final de los resultados de los estudios del monitor de glucemia no invasivo utilizando un método de error en las variables (también llamado «regresión ortogonal»). La regresión por mínimos cuadrados ordinarios supone que sólo las mediciones de las coordenadas y están asociadas a errores de medición aleatorios. A menudo ocurre que las incertidumbres de los datos recaen tanto en las coordenadas x como en las y. Este es el caso en el que tanto x como y son cantidades observadas y, por tanto, se sabe que tienen errores. El modelo de error en las variables tiene en cuenta los errores de medición de ambos conjuntos de mediciones. Entre estos modelos se encuentran Deming (20), el método de Passing y Bablok (21) y la regresión ortogonal. El método de Deming requiere la especificación de la relación entre las SD al cuadrado para dos cantidades observadas, pero no permite utilizar diferentes SD en el rango de las cantidades medidas x o y. La mayoría de los procedimientos de regresión ortogonal distribuyen el error por igual en las coordenadas x e y. En este análisis de estudios de monitores no invasivos, se utilizó el método de regresión ortogonal basado en un algoritmo descrito por Reilly et al. (22). El modelo anterior permite introducir el error de medición para ambos ejes en todo el rango de las cantidades medidas.
Mediciones de glucosa en suero de laboratorio
La concentración de glucosa en suero de laboratorio se determinó mediante el método de la tasa de consumo de oxígeno utilizando un electrodo de oxígeno (Synchron LX20 Instrument; Beckman Instruments, Brea, CA). Las DE de las mediciones de laboratorio suministradas por el Laboratorio Clínico del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut son las siguientes: para el nivel de control de calidad 1 (QC1) con una media de glucosa sérica de 61 mg/dl, DE = ±2 mg/dl; para el QC2 con una media de glucosa sérica de 120 mg/dl, DE = ±4 mg/dl; y para el QC3 con una media de glucosa sérica de 373 mg/dl, DE = ±11 mg/dl. El error relativo en todo el rango de concentraciones de glucosa fue de aproximadamente ±3,3%.