Guinguette Marais Poitevin

El AIRS consta de tres pasos: (1) reconocimiento y tolerancia, (2) respuesta inmunitaria y (3) eliminación y memoria. Estas funciones están bloqueadas en ausencia de la entrada del patógeno ssDNA (P0), pero una vez que P0 se introduce en el sistema AIRS es impulsado por una serie de reacciones de desplazamiento de la hebra mediada por el toehold del ADN y por las enzimas del ADN. Las barras de color indican las cadenas de ADN con diferentes dominios. Todos los dominios x son complementarios a x*; P0 es la secuencia patógena que posee capacidad de infección en la forma ssDNA. AM (mimetismo de células presentadoras de antígenos), BM (mimetismo de células B) y PG (generador de cebadores, que genera cebadores para el anticuerpo análogo) están inicialmente presentes como componentes dúplex, junto con CT (plantilla circular, que controla la secuencia del anticuerpo análogo) y dos enzimas funcionales, la polimerasa Phi29 y la enzima de restricción SspI. TM (imitación de células T); RCA (amplificación por ciclo de rodadura). P1 y P2 son productos de reacción de desplazamiento.

En el paso 1, en ausencia de P0, los componentes funcionales del sistema permanecen en estasis. Imitando la tolerancia inmunitaria, el estado de no respuesta de la defensa inmunitaria, la prioridad de reacción de P0 al ADN dúplex AM, así como al BM, se controla a través de las longitudes de sus correspondientes toeholds, que son segmentos cortos de ssDNA que sobresalen en los dúplex. En consecuencia, diseñamos un toehold de diez nucleótidos (nt) en AM con una velocidad de reacción de desplazamiento k de 106 M-1 s-1 y un toehold de 0 nt en BM con un valor k de 103 M-1 s-1 para la hibridación inicial de P017,18. AM puede mostrar P0, que tiene dos dominios de ssDNA, uno con una secuencia tomada del genoma de Bacillus anthracis, una bacteria Gram-positiva con forma de bastón (P), y el otro diseñado (dominio de ssDNA 2-3-4) para controlar las reacciones posteriores mediante una reacción de desplazamiento de ADN. Sin embargo, en la fase de reconocimiento y tolerancia, nuestro sistema sólo puede proceder al paso 2, la respuesta inmunitaria, cuando la cantidad de patógeno acumulado supera el umbral de AM.

Una vez alcanzado el umbral de tolerancia inmunitaria en el sistema, se activa el paso 2, la respuesta inmunitaria humoral análoga. Como se ha señalado anteriormente, durante el agotamiento de AM por la reacción de desplazamiento, uno de los productos desplazados, el ssDNA TM (mimetismo de células T), se acumula y puede utilizarse como catalizador para aumentar la velocidad de reacción entre P0 y BM, y liberar así un cebador (dominio de ssDNA 12a) para la amplificación en círculo rodante (RCA) catalizada por la ADN polimerasa, que este sistema empleará para producir el mimetismo de «anticuerpos» de ADN (P*) contra el antígeno B. anthracis (P). Así, para replicar la respuesta inmunitaria de defensa del huésped, incorporamos dos fragmentos de secuencias genómicas de B. anthracis (P) en el TC, lo que dio lugar a una rápida generación de las secuencias complementarias P*, esencialmente por amplificación enzimática, utilizando la ADN polimerasa Phi29, la polimerasa replicativa del fago B. subtilis phi29, y desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP), para imitar la generación rápida y específica de anticuerpos producida naturalmente por las células B.

En el paso 3, eliminación y memoria, del sistema propuesto era necesario imitar el proceso por el que la respuesta inmunitaria mediada por células elimina los patógenos tras la formación de un complejo anticuerpo-antígeno del organismo, que, como se ha señalado anteriormente, resulta de la activación de la respuesta inmunitaria humoral por parte de los linfocitos B. Para ello, se asumieron tres estados infecciosos: la cadena patógena original P0 y los productos de la reacción de desplazamiento (con AM y BM) P1 y P2. Todos ellos contienen un dominio patógeno infeccioso (P). Entonces, para formar el complejo anticuerpo-antígeno en el sistema, el dominio P en P0, P1 y P2 se hibrida con una gran cantidad de P* y forma regiones dúplex estables PP*. Sin embargo, aunque el sistema inmunitario del huésped vertebrado utiliza la fagocitosis como estrategia clave para eliminar los patógenos, hemos diseñado un método puramente biomecánico para imitar la activación de la respuesta inmunitaria humoral, es decir, la unión entre el P* generado y el dominio P del patógeno, seguida de un paso basado en la enzima de restricción que imita la matanza mediada por células cortando específicamente el dúplex «anticuerpo-antígeno». Más concretamente, este último paso se lleva a cabo cuando la hibridación del dominio P con P* crea un sitio de reconocimiento activo para la enzima de restricción SspI, que se extrae de una cepa de E. coli portadora del gen sspi clonado y modificado (Y98F) del sitio de restricción de la especie Sphaerotilus. De este modo, el dominio P en P0, P1 y P2 puede cortarse específicamente en dos fragmentos con los números de nucleótidos 56 y 15 (ref. 19), perdiendo así la infectividad.

A continuación, en el sistema inmunitario adaptativo, algunas células T y B se convertirán en células de memoria capaces de «recordar» patógenos específicos. Estas células de memoria desencadenarán una respuesta inmunitaria mucho más rápida en una posterior exposición al mismo patógeno. Por lo tanto, para crear un mecanismo que imite la función de memoria de las células B, recurrimos al ssDNA TM, que se produce por la reacción de desplazamiento entre P0 y AM y permanece en el sistema desde la primera exposición a P0. También describimos su catálisis del desplazamiento de P0 y BM para liberar rápidamente el cebador, y así desencadenar una reacción RCA más rápida que crea el anticuerpo para la siguiente exposición a la misma secuencia patógena. Esta reacción se define como impulsada por la entropía porque es una que evoluciona espontáneamente hacia el equilibrio termodinámico (Fig. Suplementaria 7)18. Sin TM, la velocidad de desplazamiento entre P0 y BM se vería frenada por el bloqueo efectivo de los dominios activos en BM. Sin embargo, en presencia de TM, BM puede hibridarse con TM a través de su toehold de 4 nt (dominio 5*) y luego liberar el iniciador del ssDNA (PI) y el producto lateral W1, lo que resulta en una nueva región de unión del toehold (dominio 3*) para la hibridación entre P0 y BM, que es impulsada hacia adelante termodinámicamente por la ganancia entrópica de las moléculas liberadas. Así, el efecto de memoria se produce al acelerar la velocidad de reacción entre P0 y BM utilizando el efecto catalítico del TM restante producido por el reconocimiento inicial. Así, al dejar la TM como «combustible catalítico» en el sistema, se consigue un efecto de memoria para una entrada específica de patógenos.

Verificación de la transducción de señales

Para asegurar el correcto funcionamiento de toda la red, se validó la transducción de señales en cada paso por separado. Para examinar la precisión de la función umbral de AM, utilizamos un método basado en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) para estudiar el orden de hibridación de P0 con AM y BM. Se acopló un par de fluoróforos (fluoresceína (FAM)) y un quencher (DABCYL (DAB)) en el dúplex PG para indicar la cantidad liberada de cebador para la reacción RCA. El restablecimiento de la fluorescencia sólo se produce si se supera el nivel umbral de AM, tras lo cual la reacción pasa al paso 2, la respuesta inmunitaria, basada en reacciones de desplazamiento de la hebra que pueden liberar la hebra del cebador marcada con el quencher. Por lo tanto, en presencia de 80 nM de AM, 100 nM de BM y 100 nM de PG marcado con fluoróforo/quemador, se introdujeron diferentes concentraciones de P0 (de 0 a 150 nM) en el sistema con monitorización de fluorescencia a 517 nm. Como se muestra en la Fig. 2b, el restablecimiento de la fluorescencia mostró un fuerte repunte en la concentración de P0 de 80 nM, pero poco aumento por debajo de 80 nM, lo que indica que la reacción entre P0 y BM había comenzado en el punto de agotamiento de AM. En otras palabras, el valor umbral de AM a P0 es ajustable cambiando la concentración de AM. En este caso, el punto de agotamiento, o nivel umbral, de AM se alcanzó a 80 nM, lo que indica que la reacción entre P0 y BM podría iniciar el paso 2, que, en humanos, es la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B. Para confirmar aún más este resultado, se monitorizó la cinética de fluorescencia del sistema anterior. Inicialmente, se mezclaron 80 nM de AM, 100 nM de BM y 100 nM de PG en el tampón, y se añadió una pequeña cantidad de P0 (30 nM). Como resultado de la cantidad excesiva de AM y su prioridad de reacción a P0 por los requisitos del paso 1, se produjo una cinética de restauración de fluorescencia lenta. Sin embargo, cuando se añadía continuamente más P0 (30 nM cada vez) al sistema, se observaba un fuerte aumento (después de 90 nM en total) en la cinética de fluorescencia, lo que indica que la reacción podía proceder al paso 2. Se probaron diferentes valores de umbral cambiando las concentraciones de AM y BM (Fig. Suplementaria 1). También se utilizó la electroforesis en gel para indicar el orden de las reacciones (Fig. 2 suplementaria). Como se comparte el mismo dominio de reconocimiento (2-3-4), también se observaron resultados experimentales similares al sustituir P0 por otra secuencia patógena, P0-SARS (ADN genómico del síndrome respiratorio agudo severo) (Fig. Suplementaria 3). Todos los ensayos confirmaron la función de umbral efectivo de AM en relación con la reacción entre BM y P0, y por tanto proporcionaron una imitación macroscópica del estado de «reconocimiento y tolerancia» de AIS.

a, Esquema de los pasos de reacción que ocurren en los pasos 1 y 2. W2 es el producto secundario de la reacción de desplazamiento de PI y PG. b, Gráfico de la restauración de la fluorescencia del sistema con 80 nM de AM, 100 nM de BM y 100 nM de PG marcado con FAM/DAB con diferentes concentraciones del patógeno de ssDNA P0. c, Experimentos cinéticos del sistema con 80 nM de AM, 100 nM de BM y 100 nM de PG marcado con FAM/DAB. En cada punto de tiempo, se añadieron 30 nM de P0 al tampón por separado. d, Experimentos cinéticos para estudiar el efecto catalítico de TM. La curva negra representa la cinética de fondo con 80 nM de AM, 100 nM de BM, 100 nM de PG marcado con FAM/DAB y sin P0. La curva roja muestra la cinética de reacción no catalizada con 100 nM de BM, 100 nM de PG marcado con FAM/DAB y 150 nM de P0. La curva azul muestra la cinética de reacción catalizada con 80 nM de AM, 100 nM de BM, 100 nM de PG marcado con FAM/DAB y 150 nM de P0. Los experimentos se realizaron a 25 °C en tampón Tris-HCl 50 mM que contenía 10 mM de MgCl2. a.u., unidades arbitrarias.

Otra función significativa de AM es producir ssDNA TM catalítico para facilitar la reacción de hibridación entre P0 y BM, que, según Zhang et al.18, El ssDNA TM no sólo es importante para facilitar la hibridación entre P0 y BM, sino que también es clave para la formación de «células de memoria mimética». Por lo tanto, para demostrar el efecto catalizador de la TM, seguimos utilizando nuestro modelo de información basado en FRET, como se ha descrito anteriormente. En consecuencia, se incubaron en tampón 80 nM de AM, 100 nM de BM y 100 nM de PG marcado con FAM/DAB. Después, se añadieron 150 nM de P0 al sistema. Se utilizó una cantidad de P0 superior a la de AM para superar el valor umbral. La TM se genera en el paso 1 como resultado de la reacción entre P0 y AM. Así, el P0, cuando supera el umbral (tal y como se establece al controlar la concentración de AM), da lugar a su vez a una reacción catalítica entre el exceso de P0 y la TM por entropía que puede restaurar rápidamente la fluorescencia del sistema. Como comparación, se añadió la misma concentración de P0 directamente a una solución con 100 nM de BM y 100 nM de PG marcada con FAM/DAB, pero sin AM. Como se muestra en la Fig. 2d, las mediciones de la cinética de fluorescencia de la reacción catalizada mostraron una aceleración de más de 500 veces en contraste con la reacción sin catálisis18,20. Por lo tanto, como se ha explicado anteriormente, la TM liberada podría servir como memoria específica de mimetismo, lo que resulta en una respuesta inmune más fuerte y rápida para la siguiente exposición al mismo patógeno. Posteriormente, también confirmamos que la cantidad de P* generada a partir de la amplificación enzimática para la hibridación con el dominio P en P0, P1 y P2 podía ser determinada por la cantidad de cebador, haciendo así que la reacción enzimática fuera controlable por las reacciones previas en los pasos 1 y 2 (véase la información suplementaria). Además, se estudió la digestión basada en enzimas de restricción del complejo antígeno-anticuerpo generado y se muestra en la Información Suplementaria.

Rendimiento de todo el sistema

Después de confirmar el correcto funcionamiento de cada paso, probamos además el rendimiento de todo el sistema con la misma entrada de cadena patógena del genoma de B. anthracis (P0). Para confirmar la tolerancia del AIRS, se añadió una pequeña cantidad de P0 (100 nM) al sistema y se monitorizó la fluorescencia en tiempo real. A continuación, diseñamos una baliza molecular de ADN (MB-R) para informar de la cantidad de producto RCA de forma fluorescente utilizando la secuencia genómica P del patógeno B. anthracis como bucle. La MB-R podría ser abierta por los productos de la RCA, es decir, P*, y así exhibir la restauración de la fluorescencia que representa diferentes cantidades de P*. La figura 3a muestra que la cinética de fluorescencia es similar a la que se produce sin P0, lo que confirma que el sistema no se activa para producir P* cuando la cantidad de patógeno está por debajo del nivel de tolerancia inmunitaria (es decir, un umbral de 200 nM). Sin embargo, cuando se añadieron otros 150 nM de P0 al sistema para imitar una segunda exposición al mismo patógeno, el restablecimiento de la fluorescencia mostró un comportamiento cinético mucho más rápido, lo que indica la producción de una gran cantidad de P* y una activación exitosa de la respuesta inmunitaria. Además, la respuesta más rápida durante la segunda exposición también confirma el efecto de memoria de este sistema para un patógeno específico. Si se utiliza P0-SARS como entrada del patógeno y una baliza molecular codificada con P0-SARS (MB-R-SARS) como reportero, se observan tendencias de fluorescencia-respuesta similares, como se muestra en la Fig. 3b, lo que indica que AIRS funciona potencialmente para una segunda entrada del patógeno. También utilizamos un sistema reportero de fluorescencia diferente para indicar la cantidad de P* generada, que se muestra en la Fig. Suplementaria 10.

a,b, La cinética de fluorescencia de la generación del anticuerpo mimético P*(P*-SARS) se monitorizó con diferentes concentraciones de P0 (a) y P0-SARS (b). Aquí utilizamos el doble de cantidades de los componentes individuales del ADN en comparación con los utilizados para los datos mostrados en la Fig. 2 para asegurar que las concentraciones eran consistentes con el experimento del gel.

Usando un reportero de fluorescencia en experimentos independientes, se demostró que AIRS funcionaba igualmente bien con dos entradas de patógenos diferentes. Por lo tanto, a continuación estudiamos si también podía funcionar cuando se presentaban dos entradas diferentes simultáneamente. Para ello, se introdujeron P0 y P0-SARS juntos en una solución que contenía todos los componentes (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0,5 U μl-1 Phi29 y 250 μM dNTP). Al igual que en el experimento anterior, también se añadieron a la mezcla dos balizas moleculares diferentes con el mismo fluoróforo y quencher (MB-R y MB-R-SARS) para informar de las cantidades de ambos productos RCA de forma fluorescente, es decir, P* y P*-SARS. Como se muestra en la Fig. Suplementaria 14, mientras las entradas de ambos patógenos estén por debajo del nivel de tolerancia inmunológica (umbral de 300 nM), el AIRS no se activa y la fluorescencia permanece inalterada en comparación con la señal de fondo. Sin embargo, cuando las concentraciones aumentan hasta un nivel superior al umbral de uno de los patógenos, o de ambos, la fluorescencia se restablece, lo que indica que ambas entradas de patógenos pueden generar el correspondiente mimetismo de anticuerpos cuando se mezclan. Esto confirma que AIRS tiene la capacidad de responder simultáneamente a dos entradas de patógenos diferentes.

Para caracterizar aún más el funcionamiento sin errores del sistema AIRS, utilizamos la electroforesis en gel para analizar la cantidad final de P*. Como se muestra en la Fig. 4a, sólo se observa una banda nítida de alto peso molecular cuando la cantidad de patógeno supera el nivel umbral (100 + 150 nM), lo que coincide con los resultados de fluorescencia anteriores. Para estudiar la unión entre la cadena de entrada del patógeno (P0) y la cadena de imitación del anticuerpo (P*) en el paso 3, modificamos P0 con un fluoróforo (FAM). Tras la generación de P*, se confirmó la existencia de la hibridación entre P0 y P*, ya que se pudo observar una banda de alto peso molecular en el canal de imagen de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Fig. 13 suplementaria). Con la adición de más P0 marcado con FAM (de uno a 250 en exceso) al sistema, se siguió observando la hibridación entre el exceso de P0 y el P* generado, lo que indica que AIRS podía unir suficientemente la hebra de entrada del patógeno en exceso (P0) por RCA. Por último, incubamos la enzima de restricción (2 U µl-1) junto con todos los demás componentes (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 y 250 µM dNTP). Tras introducir una concentración excesiva de P0 marcado con FAM (500 nM) para superar la tolerancia inmunológica del sistema, se descubrió una banda de fragmentos de digestión con una modificación de FAM (56 nt) bajo el canal FITC, lo que permite concluir que el patógeno había sido digerido con éxito (Fig. 4b). Curiosamente, si se sustituye P0 por una entrada de polimorfismo de doble nucleótido (P0-mis), todavía se puede generar un anticuerpo de imitación P* con una concentración excesiva de P0-mis. Sin embargo, la hibridación entre P0-mis y P* no puede ser digerida por la enzima de restricción SspI, lo que demuestra que el sistema AIRS es sensible al reconocimiento del polimorfismo de nucleótidos de la entrada del patógeno (Fig. 11 suplementaria). AIRS ha sido diseñado con dos capas de selectividad, lo que hace posible que el sistema diferencie P0 de una entrada de polimorfismo de doble nucleótido, P0-mis. Para explicarlo, la capacidad de unión relativamente más débil entre P0-mis y P* en comparación con la de P0 y P* hace que el dúplex P0-mis-P* sea menos estable. Además, un dúplex P0-mis-P* con desajustes no puede formar un sitio de unión de reconocimiento efectivo con la enzima de restricción SspI (AAT-ATT), y por lo tanto reduce la tasa de digestión de la enzima, lo que, a su vez, da lugar a un producto de escisión mucho menor a partir de la P0-mis de entrada (Fig. 11 suplementaria). Por el contrario, debido a que la hibridación de P0-SARS con P* crea un sitio de unión de reconocimiento idéntico al de la enzima de restricción SspI, se encontraron resultados de electroforesis en gel similares (Fig. 4c), lo que confirma de nuevo que AIRS puede funcionar para diferentes entradas de patógenos.

a, Análisis de la generación de mimetismo de anticuerpos P* mediante gel de agarosa (1,5%). L, escalera de 100 pares de bases. La imagen se tomó bajo un canal de imagen de bromuro de etidio (EB) (λexcitación = 520 nm, λemisión = 605 nm). b, Validación del rendimiento del sistema análogo AIRS con la hebra patógena P0 por gel de agarosa (1%). M es la mezcla de componentes originales presentes en el AIRS. Aquí M = mezcla de 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 y 250 µM dNTP; tiempo de incubación, una hora. Carril 1, M + 0 nM P0 marcado con FAM; carril 2, M + 100 nM P0 marcado con FAM; carril 3, M + 500 nM P0 marcado con FAM; carril 4, M + 100 nM P0 marcado con FAM + 2 U µl-1 SspI; carril 5, M + 500 nM P0 marcado con FAM + 2 U µl-1 SspI; L, escalera de 1 kb. c, Validación del rendimiento del sistema análogo AIRS con la hebra patógena P0-SARS mediante gel de agarosa (1%). M = mezcla de 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0,5 U µl-1 Phi29 y 250 µM dNTP; tiempo de incubación, una hora. Carril 1, M + 0 nM P0-SARS marcado con FAM; carril 2, M + 100 nM P0-SARS marcado con FAM; carril 3, M + 500 nM P0-SARS marcado con FAM; carril 4, M + 100 nM P0-SARS marcado con FAM + 2 U µl-1 SspI; carril 5, M + 500 nM P0-SARS marcado con FAM + 2 U µl-1 SspI; L, escalera de 1 kb.

Finalmente, como se ha señalado anteriormente, la especificidad del sistema depende principalmente de la enzima de restricción y de la secuencia de CT (véase la Información complementaria). Cuando desafiamos el sistema introduciendo P0-SARS marcado con FAM como entrada del patógeno, pero CT para B. anthracis como plantilla de amplificación, no apareció ninguna banda fluorescente obvia de alto peso molecular ni con pequeñas ni con grandes cantidades de P0-SARS bajo el canal FITC debido a la falta de hibridación entre P0-SARS y P* generada específicamente para B. anthracis (Fig. 12 suplementaria).