System construction
Als een vreemd doelwit eenmaal de drempel van immuuntolerantie heeft overschreden, worden de humorale en cellulaire componenten van het gewervelde immuunsysteem tot actie opgeroepen. Een belangrijke functie is de antigeenpresentatie, die het mechanisme voor herkenning en reactie levert. B-cellen scheiden antilichamen af, die zich binden aan een antigeen en dit markeren, terwijl T-cellen de doelwitcellen aanvallen. Zowel T- als B-cellen spelen ook een rol bij de vorming van geheugencellen. Zoals blijkt uit fig. 1, hebben wij deze reeks gebeurtenissen onderverdeeld in drie stappen (herkenning en tolerantie, immuunrespons, en doding en geheugen) onder controle van vier functionele DNA-componenten, waaronder de DNA-duplexen AM (mimicry van de antigeenpresenterende cel (APC)), BM (mimicry van de B-cel), PG (primer generator, die primers genereert voor het analoge antilichaam) en enkelstrengs circulair DNA CT (circulaire template, die de sequentie van het analoge antilichaam bepaalt), alsmede twee enzymen (Phi29 DNA polymerase en SspI restrictie-enzym) die in staat zijn autonoom en programmeerbaar te reageren op een inkomend stuk enkelstrengs DNA (ssDNA) pathogeen input (P0) afkomstig van het bacteriële genoom. Wanneer er geen P0 aanwezig is, wordt het systeem in een stabiele, evenwichtige toestand gehouden door de effectieve blokkering van de functionele domeinen in elke component. Wanneer het systeem echter door P0 wordt uitgedaagd, worden deze functionele domeinen geactiveerd in een reeks stappen die zijn ontworpen om de drie hierboven beschreven stappen na te bootsen.
AIRS bestaat uit drie stappen: (1) herkenning en tolerantie, (2) immuunrespons en (3) doding en geheugen. Deze functies worden geblokkeerd in afwezigheid van ssDNA-pathogeen input (P0), maar zodra P0 in het AIRS-systeem wordt geïntroduceerd, wordt het aangestuurd door een reeks DNA-toehold-gemedieerde strengverschuivingen en DNA-enzymreacties. Gekleurde staven geven DNA strengen met verschillende domeinen aan. Alle x-domeinen zijn complementair aan x*; P0 is de pathogene sequentie die infectievermogen bezit in de ssDNA-vorm. AM (antigeen-presenterende cel mimicry), BM (B-cel mimicry) en PG (primer generator, die primers genereert voor het analoge antilichaam) zijn aanvankelijk aanwezig als duplex-componenten, samen met CT (circulair sjabloon, dat de sequentie van het analoge antilichaam controleert) en twee functionele enzymen, Phi29 polymerase en SspI restrictie-enzym. TM (T Cell Mimicry); RCA (rolling cycle amplification). P1 en P2 zijn verdringingsreactieproducten.
In stap 1, bij afwezigheid van P0, blijven de functionele componenten van het systeem in stase. De reactieprioriteit van P0 op duplex DNA AM en op BM, die immuuntolerantie nabootst, wordt bepaald door de lengte van de corresponderende toeholds, de korte ssDNA overhangsegmenten in duplexen. Daarom hebben we een tien nucleotide (nt) toehold in AM met een verplaatsing reactiesnelheid k van 106 M-1 s-1 en een 0 nt toehold in BM met een k-waarde van 103 M-1 s-1 voor de eerste P0 hybridisatie 17,18. AM kan P0 weergeven, dat twee ssDNA-domeinen heeft, waarvan het ene een sequentie heeft uit het genoom van Bacillus anthracis, een Gram-positieve, staafvormige bacterie (P), en het andere is ontworpen (ssDNA-domein 2-3-4) om stroomafwaartse reacties te controleren via een DNA-verplaatsingsreactie. In de herkennings- en tolerantiefase kan ons systeem echter pas overgaan tot stap 2, de immuunrespons, wanneer de hoeveelheid geaccumuleerde ziekteverwekker de drempel van AM overschrijdt.
Als de drempel van immuuntolerantie in het systeem is bereikt, wordt stap 2, de analoge humorale immuunrespons, geactiveerd. Zoals eerder opgemerkt, accumuleert tijdens de depletie van AM door de verdringingsreactie een van de verdrongen producten, ssDNA TM (T-cel mimicry), dat als katalysator kan worden gebruikt om de reactiesnelheid tussen P0 en BM te verhogen, en zo een primer (ssDNA domein 12a) vrij te maken voor de DNA-polymerase-gekatalyseerde rolling-circle amplificatie (RCA), die dit systeem zal gebruiken om DNA-‘antilichaam’-imimicry (P*) tegen het antigeen B. anthracis (P) te produceren. Om de immuunrespons van de gastheer na te bootsen, hebben wij dus twee B. anthracis-genoomsequentiefragmenten (P) in de CT ingebouwd, wat resulteerde in een snelle generatie van de complementaire sequenties P*, hoofdzakelijk door enzymatische amplificatie, met gebruikmaking van Phi29 DNA-polymerase, het replicatieve polymerase van de B. subtilis faag phi29, en desoxyribonucleotide trifosfaat (dNTP), om de snelle en antilichaam-specifieke generatie na te bootsen die van nature door B-cellen wordt geproduceerd.
In stap 3, doding en geheugen, van het voorgestelde systeem moest het proces worden nagebootst waarbij de celgemedieerde immuunrespons ziekteverwekkers elimineert na de vorming van een antilichaam-antigeencomplex in het lichaam, dat, zoals hierboven is opgemerkt, het resultaat is van de activering van de humorale immuunrespons door B-lymfocyten. Om dit te bereiken, werd uitgegaan van drie infectieuze toestanden: de oorspronkelijke pathogeenstreng P0 en de verdringingsreactieproducten (met AM en BM) P1 en P2. Samen bevatten deze alle een infectieus pathogeen domein (P). Vervolgens hybridiseert, om het antilichaam-antigeen complex in het systeem te vormen, het P-domein in P0, P1 en P2 met een grote hoeveelheid P* en vormt zo stabiele duplexregio’s PP*. Hoewel het gewervelde immuunsysteem van de gastheer gebruik maakt van fagocytose als een belangrijke strategie bij het verwijderen van pathogenen, hebben wij een zuiver biomechanische methode ontworpen om de activering van de humorale immuunrespons na te bootsen, dat wil zeggen de binding tussen het gegenereerde P* en het P-domein van de pathogeen, gevolgd door een op restrictie-enzymen gebaseerde stap die celgemedieerde doding nabootst door het ‘antilichaam-antigeen’-duplex specifiek door te knippen. Meer specifiek wordt deze laatste stap bereikt wanneer de hybridisatie van het P-domein met P* een actieve herkenningsplaats creëert voor het restrictie-enzym SspI, dat wordt geëxtraheerd uit een E. coli-stam die het gekloonde en gemodificeerde (Y98F) sspi-gen draagt van de restrictieplaats van Sphaerotilus species. Op deze wijze kan het P-domein in P0, P1 en P2 specifiek worden geknipt in twee fragmenten met de nucleotidenummers 56 en 15 (ref. 19), waardoor de infectiviteit verloren gaat.
Na verloop van tijd zullen in het adaptieve immuunsysteem sommige T- en B-cellen geheugencellen worden die in staat zijn specifieke pathogenen te “onthouden”. Deze geheugencellen zullen bij een volgende blootstelling aan dezelfde ziekteverwekker een veel snellere immuunrespons uitlokken. Om een mechanisme te creëren dat de geheugenfunctie van B-cellen nabootst, wendden wij ons tot ssDNA TM, dat wordt geproduceerd door de verdringingsreactie tussen P0 en AM en dat in het systeem blijft vanaf de eerste blootstelling aan P0. We beschrijven ook zijn katalyse van P0 en BM verplaatsing om primer snel vrij te geven, en zo een snellere RCA reactie op gang te brengen die antilichaam aanmaakt voor de volgende blootstelling aan dezelfde pathogene sequentie. Deze reactie wordt gedefinieerd als entropie gedreven omdat het een reactie is die spontaan evolueert naar thermodynamisch evenwicht (supplementaire Fig. 7) 18. Zonder TM zou de verplaatsingssnelheid tussen P0 en BM worden vertraagd door de effectieve blokkering van actieve domeinen op BM. Echter, in aanwezigheid van TM, kan BM hybridiseren met TM door zijn 4 nt teenhold (domein 5*) en dan de ssDNA primer initiator (PI) en het bijproduct W1 vrijgeven, wat resulteert in een nieuwe teenhold bindingsregio (domein 3*) voor de hybridisatie tussen P0 en BM, die thermodynamisch naar voren wordt gedreven door de entropische winst van de vrijgekomen moleculen. Het geheugeneffect ontstaat dus door de reactiesnelheid tussen P0 en BM te versnellen met behulp van het katalytische effect van het resterende TM dat door de eerste herkenning ontstaat. Door TM als ‘katalytische brandstof’ in het systeem te laten, wordt dus een geheugeneffect voor een specifieke pathogeeninput bereikt.
Verificatie van signaaltransductie
Om de goede werking van het gehele netwerk te verzekeren, werd de signaaltransductie bij elke stap afzonderlijk gevalideerd. Om de precisie van de drempelfunctie van AM te onderzoeken, gebruikten we een Förster resonantie energie overdracht (FRET)-gebaseerde methode om de hybridisatievolgorde van P0 met AM en BM te bestuderen. Een fluorofoor (fluoresceïne (FAM)) en quencher (DABCYL (DAB)) paar werd gekoppeld in de PG duplex om de vrijgekomen hoeveelheid primer voor de RCA reactie aan te geven. Herstel van de fluorescentie treedt alleen op als de drempelwaarde van AM wordt overschreden, waarna de reactie overgaat tot stap 2, immuunreactie, op basis van streng-verplaatsingsreacties waarbij de met een quencher gelabelde primerstreng kan vrijkomen. Daarom werden in aanwezigheid van 80 nM AM, 100 nM BM en 100 nM fluorofoor/quencher-gelabelde PG verschillende concentraties P0 (van 0 tot 150 nM) in het systeem gebracht met fluorescentiebewaking bij 517 nm. Zoals getoond in Fig. 2b, de fluorescentie restauratie vertoonde een scherpe opleving bij de P0 concentratie van 80 nM, maar weinig toename onder 80 nM, wat aangeeft dat de reactie tussen P0 en BM was begonnen bij het depletie punt van AM. Met andere woorden, de drempelwaarde van AM tot P0 is instelbaar door de concentratie van AM te veranderen. In dit geval werd het depletiepunt, of drempelwaarde, van AM bereikt bij 80 nM, wat aangeeft dat de reactie tussen P0 en BM stap 2 kon inleiden, die bij mensen de productie van antilichamen door B-lymfocyten is. Om dit resultaat verder te bevestigen werd de kinetiek van de fluorescentie van bovengenoemd systeem gecontroleerd. Aanvankelijk werden 80 nM AM, 100 nM BM en 100 nM PG in de buffer gemengd, waarna een kleine hoeveelheid P0 (30 nM) werd toegevoegd. Als gevolg van de overmaat AM en de prioriteit van de reactie met P0 door de eisen van stap 1, trad een langzame fluorescentieherstel-kinetiek op. Wanneer echter voortdurend meer P0 (telkens 30 nM) aan het systeem werd toegevoegd, werd een sterke toename (na in totaal 90 nM) van de fluorescentiekinetiek waargenomen, hetgeen erop wijst dat de reactie naar stap 2 kon overgaan. Verschillende drempelwaarden werden getest door het veranderen van de concentraties van AM en BM (supplementaire Fig. 1). Gelelektroforese werd ook gebruikt om de volgorde van de reacties aan te geven (supplementaire fig. 2). Aangezien hetzelfde herkenningsdomein (2-3-4) wordt gedeeld, werden soortgelijke experimentele resultaten ook waargenomen door P0 te vervangen door een andere pathogeensequentie, P0-SARS (severe acute respiratory syndrome coronavirus genomic DNA) (supplementaire fig. 3). Alle testen bevestigden de effectieve drempelfunctie van AM ten opzichte van de reactie tussen BM en P0, en zorgden dus voor een macroscopische nabootsing van de “herkenning en tolerantie” toestand van AIS.
a, Schema van de reactiestappen die in stap 1 en stap 2 voorkomen. W2 is het bijproduct van de verdringingsreactie van PI en PG. b, Plot van fluorescentieherstel van het systeem met 80 nM AM, 100 nM BM en 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG met verschillende concentraties van de ssDNA-ziekteverwekker P0. c, Kinetische experimenten van het systeem met 80 nM AM, 100 nM BM en 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG. Op elk tijdstip werd 30 nM P0 afzonderlijk aan de buffer toegevoegd. d) Kinetische experimenten om het katalytische effect van TM te bestuderen. De zwarte curve geeft de achtergrondkinetiek weer met 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG en geen P0. De rode curve toont de ongekatalyseerde reactiekinetiek met 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG en 150 nM P0. De blauwe curve toont de gekatalyseerde reactiekinetiek met 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG en 150 nM P0. De experimenten werden uitgevoerd bij 25 °C in 50 mM Tris-HCl buffer die 10 mM MgCl2 bevatte. a.u., arbitrary units.
Een andere belangrijke functie van AM is het produceren van katalytisch ssDNA TM om de hybridisatiereactie tussen P0 en BM te vergemakkelijken, die volgens Zhang et al.18, ssDNA TM is niet alleen belangrijk voor het vergemakkelijken van de hybridisatie tussen P0 en BM, maar het is ook de sleutel tot de vorming van ‘mimetische geheugencellen’. Daarom, om het katalytische effect van TM te bewijzen, bleven wij ons FRET-gebaseerde rapporteringsmodel gebruiken, zoals hierboven beschreven. Dienovereenkomstig werden 80 nM AM, 100 nM BM en 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG in buffer geïncubeerd. Daarna werd 150 nM P0 aan het systeem toegevoegd. We gebruikten een overmaat P0 aan AM om de drempelwaarde te overwinnen. TM wordt in stap 1 gegenereerd als gevolg van de reactie tussen P0 en AM. Wanneer P0 dus de drempelwaarde overschrijdt (zoals ingesteld door de concentratie van AM te regelen), leidt dit op zijn beurt tot een katalytische reactie tussen de overmaat P0 en TM door entropie die de fluorescentie van het systeem snel kan herstellen. Ter vergelijking werd dezelfde concentratie P0 direct toegevoegd aan een oplossing met 100 nM BM en 100 nM FAM/DAB-gelabeld PG, maar geen AM. Zoals blijkt uit Fig. 2d, vertoonden de metingen van de fluorescentiekinetiek van de gekatalyseerde reactie een meer dan 500-voudige versnelling in tegenstelling tot die zonder katalyse18,20. Zoals hierboven uiteengezet, zou het vrijgemaakte TM dus kunnen dienen als specifieke geheugennabootsing, die resulteert in een sterkere en snellere immuunrespons bij de volgende blootstelling aan dezelfde ziekteverwekker. Daarna hebben we ook bevestigd dat de hoeveelheid P* die wordt gegenereerd door enzymatische amplificatie voor hybridisatie met domein P in P0, P1 en P2 kan worden bepaald door de hoeveelheid primer, waardoor de enzymatische reactie controleerbaar wordt door stroomopwaartse reacties in stap 1 en 2 (zie de Aanvullende Informatie). Bovendien werd de restrictie-enzym-gebaseerde digestie van het gegenereerde antigeen-antilichaam complex bestudeerd en wordt getoond in de Supplementary Information.
Whole-system performance
Na bevestiging van de goede werking van elke stap, testten we verder de prestaties van het gehele systeem met dezelfde pathogene streng input van het B. anthracis genoom (P0). Om de tolerantie van AIRS te bevestigen, werd een kleine hoeveelheid P0 (100 nM) aan het systeem toegevoegd, en de fluorescentie werd in real time gecontroleerd. Vervolgens ontwierpen we een DNA moleculair baken (MB-R) om de hoeveelheid RCA product fluorescent te rapporteren door de pathogene B. anthracis genomische sequentie P als zijn lus te gebruiken. MB-R kan worden geopend door de RCA-producten, dat is P*, en daardoor fluorescentieherstel vertonen dat verschillende hoeveelheden P* vertegenwoordigt. Figuur 3a toont dat de fluorescentiekinetiek gelijk is aan die zonder P0, wat bevestigt dat het systeem niet geactiveerd wordt om P* te produceren wanneer de hoeveelheid pathogeen onder het niveau van immuuntolerantie ligt (d.w.z. een drempelwaarde van 200 nM). Wanneer echter nog eens 150 nM P0 aan het systeem werd toegevoegd om een tweede blootstelling aan dezelfde ziekteverwekker na te bootsen, vertoonde het fluorescentieherstel een veel sneller kinetisch gedrag, wat wijst op de productie van een grote hoeveelheid P* en een geslaagde inwerkingstelling van de immuunrespons. Bovendien bevestigt de snellere reactie tijdens de tweede blootstelling ook het geheugeneffect van dit systeem voor een specifieke ziekteverwekker. Als P0-SARS wordt gebruikt als pathogeen input en een moleculair baken gecodeerd met P0-SARS (MB-R-SARS) wordt gebruikt als de reporter, worden vergelijkbare fluorescentie-respons trends gezien, zoals weergegeven in Fig. 3b, wat aangeeft dat AIRS potentieel werkt voor een tweede pathogeen input. We hebben ook een ander fluorescentie-rapportagesysteem gebruikt om de hoeveelheid gegenereerde P* aan te geven, wat wordt getoond in Aanvullende Fig. 10.
a,b, De fluorescentiekinetiek van de antilichaam mimicry P*(P*-SARS) generatie werd gecontroleerd met verschillende concentraties van P0 (a) en P0-SARS (b). Hier gebruikten we dubbele hoeveelheden van de afzonderlijke DNA-componenten vergeleken met die gebruikt voor de gegevens getoond in Fig. 2 om ervoor te zorgen dat de concentraties consistent waren met het gel-experiment.
Gebruik makend van een fluorescentie-reporter in onafhankelijke experimenten, werd aangetoond dat AIRS even goed werkt met twee verschillende pathogeeninputs. Daarom hebben we vervolgens onderzocht of het ook kan werken wanneer twee verschillende ingangen tegelijkertijd worden aangeboden. Om dit te bepalen werden P0 en P0-SARS samen ingebracht in een oplossing die alle componenten bevatte (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0,5 U pi-1 Phi29 en 250 uM dNTP). Zoals in het experiment hierboven, twee verschillende moleculaire bakens met dezelfde fluorofoor en quencher (MB-R en MB-R-SARS) werden ook toegevoegd aan het mengsel om de hoeveelheden van beide RCA producten fluorescerende, dat wil zeggen P * en P *-SARS rapporteren. Zoals blijkt uit aanvullende fig. 14, zolang beide pathogeeninputs onder het niveau van immuuntolerantie liggen (drempel van 300 nM), wordt AIRS niet geactiveerd en blijft de fluorescentie onveranderd ten opzichte van het achtergrondsignaal. Echter, wanneer de concentraties toenemen tot een niveau hoger dan de drempel voor een, of beide, pathogenen, wordt de fluorescentie hersteld, wat aangeeft dat beide pathogeeninputs overeenkomstige antilichaam mimicry kunnen genereren wanneer ze samen worden gemengd. Dit bevestigt dat AIRS de capaciteit heeft om gelijktijdig te reageren op twee verschillende pathogeeninputs.
Om de foutloze werking van het AIRS-systeem verder te karakteriseren, gebruikten we gelelektroforese om de uiteindelijke hoeveelheid P* te analyseren. Zoals te zien is in Fig. 4a, is er slechts één scherpe band met hoog moleculair gewicht te zien wanneer de hoeveelheid pathogeen het drempelniveau (100 + 150 nM) overschrijdt, hetgeen consistent is met de eerdere fluorescentieresultaten. Om de binding tussen de pathogeen ingangsstreng (P0) en de antilichaam mimicry streng (P*) in stap 3 te bestuderen, hebben we P0 gemodificeerd met een fluorofoor (FAM). Na de generatie van P *, de hybridisatie tussen P0 en P * werd bevestigd aanwezig te zijn, als een band van hoog moleculair gewicht kan worden gezien in de fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-beeldvorming kanaal (Supplementary Fig. 13). Met de toevoeging van meer FAM-gelabelde P0 (van een tot 250 overmaat) aan het systeem, werd de hybridisatie tussen overmaat P0 en gegenereerde P * nog steeds waargenomen, wat aangeeft dat AIRS de overmaat pathogeen ingangsstreng (P0) voldoende kon binden door RCA. Tenslotte incubeerden we het restrictie-enzym (2 U µl-1) samen met alle andere componenten (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0.5 U µl-1 Phi29 en 250 µM dNTP). Na het inbrengen van een overconcentratie van FAM-gelabeld P0 (500 nM) om de immuuntolerantie van het systeem te overschrijden, werd onder het FITC-kanaal een fragmentband met een FAM-modificatie (56 nt) ontdekt, wat tot de conclusie leidt dat de ziekteverwekker met succes (Fig. 4b) was verteerd. Interessant is dat als P0 wordt vervangen door een dubbel-nucleotide polymorfisme ingang (P0-mis), antilichaam mimicry P* nog steeds kan worden gegenereerd met een overconcentratie van P0-mis. Echter, de hybridisatie tussen P0-mis en P * kan niet worden verteerd door het SspI restrictie enzym, waaruit blijkt dat het AIRS systeem gevoelig is voor de herkenning van nucleotide polymorfisme van de pathogeen input (Supplementary Fig. 11). AIRS is ontworpen met twee lagen van selectiviteit, waardoor het systeem in staat is P0 te onderscheiden van een input van dubbel-nucleotide polymorfisme, P0-mis. De verklaring hiervoor is dat het relatief zwakkere bindingsvermogen tussen P0-mis en P* in vergelijking met dat tussen P0 en P* de P0-mis-P* duplex minder stabiel maakt. Bovendien kan een P0-mis-P* mismatch duplex geen effectieve herkenning bindingsplaats vormen met het restrictie-enzym SspI (AAT-ATT), en daarmee de spijsvertering van het enzym te verminderen, die op zijn beurt resulteert in veel minder splitsingsproduct van de input P0-mis (Supplementary Fig. 11). Daarentegen, omdat de hybridisatie van P0-SARS met P* een herkenningsbindingsplaats creëert die identiek is aan die van het restrictie-enzym SspI, werden vergelijkbare gelelektroforeseresultaten gevonden (Fig. 4c), wat opnieuw bevestigt dat AIRS kan werken voor verschillende pathogeeninputs.
a, Analyse van antilichaam mimicry P* generatie door agarose gel (1,5%). L, ladder van 100 basenparen. Het beeld is gemaakt onder een ethidiumbromide (EB) beeldvormingskanaal (λexcitatie = 520 nm, λemissie = 605 nm). b, Validatie van de prestaties van het AIRS-analoge systeem met pathogene streng P0 door agarosegel (1%). M is het mengsel van oorspronkelijk aanwezige componenten in de AIRS. Hier M = mengsel van 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 en 250 µM dNTP; incubatietijd, één uur. Baan 1, M + 0 nM FAM-gelabeld P0; baan 2, M + 100 nM FAM-gelabeld P0; baan 3, M + 500 nM FAM-gelabeld P0; baan 4, M + 100 nM FAM-gelabeld P0 + 2 U µl-1 SspI; baan 5, M + 500 nM FAM-gelabeld P0 + 2 U µl-1 SspI; L, 1 kb ladder. c, Validatie van de prestaties van het AIRS-analoge systeem met de pathogene streng P0-SARS door agarosegel (1%). M = mengsel van 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0,5 U µl-1 Phi29 en 250 µM dNTP; incubatietijd, één uur. Baan 1, M + 0 nM FAM-gelabeld P0-SARS; baan 2, M + 100 nM FAM-gelabeld P0-SARS; baan 3, M + 500 nM FAM-gelabeld P0-SARS; baan 4, M + 100 nM FAM-gelabeld P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; baan 5, M + 500 nM FAM-gelabeld P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; L, ladder van 1 kb.
Ten slotte hangt, zoals hierboven opgemerkt, de specificiteit van het systeem voornamelijk af van het restrictie-enzym en de sequentie van CT (zie de aanvullende informatie). Toen wij het systeem uitdaagden door FAM-gelabeld P0-SARS als pathogene input in te voeren, maar CT voor B. anthracis als amplificatiesjabloon, verscheen er geen duidelijke fluorescerende band van hoog molecuulgewicht met kleine of grote hoeveelheden P0-SARS onder het FITC-kanaal wegens het ontbreken van hybridisatie tussen P0-SARS en P* specifiek gegenereerd voor B. anthracis (supplementaire fig. 12).