Fc Silent™ is een genetisch gemanipuleerd Fc-domein dat bij Absolute Antibody is ontwikkeld voor onderzoek en assay-ontwikkeling. Het bevat belangrijke puntmutaties die de binding van Fc-receptoren (FcγR, FcR) verhinderen, waardoor de antilichaam gerichte cytotoxiciteit (ADCC) effectorfunctie wordt opgeheven.
Onze Fc Silent™ antilichamen stellen onderzoekers daarom in staat om de effectorfunctie in vivo te verwijderen en niet-specifieke achtergrond in kleuringmethoden te verminderen. In vivo profiteren de antilichamen van de lange plasmahalfwaardetijd (t1/2) die met het Fc-domein wordt geassocieerd, zonder de cytolytische immuuneffectormechanismen die met het wild-type Fc-domein worden geassocieerd. In vitro kunnen de antilichamen worden gebruikt voor flowcytometrie- en immunohistochemietoepassingen (IHC) om niet-specifieke achtergrondsignalen als gevolg van Fc-receptorbinding te verminderen. De Fc Silent™ mutaties hebben geen invloed op andere eigenschappen van het antilichaam, waaronder hun compatibiliteit met secundaire antilichamen.
Alle Absolute Antibody antilichamen en fusie-eiwitten zijn beschikbaar met het Fc Silent™ domein. Onze reagentia catalogus bevat soort-specifieke Fc Silent™ domeinen, zoals mens, muis, konijn, rat en hamster, op voorraad en klaar voor aankoop. Als u uw antilichaam van keuze niet in het Fc Silent™ formaat ziet, neem dan contact met ons op – wij produceren het graag voor u!
Voor meer informatie over de invloed van Fc receptoren op de effector functie of Fc engineering inspanningen, bekijk onze Antibody Resource, een gratis online referentiebron voor onderzoekers.
Fc Silent™ Binding Data
Muis IgG2a en rat IgG2b isotypen zijn bekend om hun sterke binding met Fc receptoren, ongeacht de specificiteit van het test-antilichaam. Isotypecontroles worden gebruikt om de onderzoeker in staat te stellen onderscheid te maken tussen specifieke en niet-specifieke achtergrondsignalen. In figuur 1 zien we hoe muismacrofagen bijna even sterk gelabeld worden door een rat IgG2b isotype controle als door een anti-F4/80. Overschakeling op Fc Silent™ antilichamen resulteert in betrouwbare gegevens met achtergrondkleuring niet te onderscheiden van een secundaire-antilichaam-only controle. Dit toont ook aan dat Fc Silent™ antilichamen compatibel zijn met standaard secundaire antilichamen.
Figuur 2 gebruikt oppervlakte plasmon resonantie (SPR) en directe competitieve remming ELISA om aan te tonen dat het Fc Silent™ formaat niet interageert met muriene of humane Fc receptoren. Deze gegevens werden verstrekt door Dr. Stephen Beers aan de Universiteit van Southampton.
Figuur 1. Flowcytometrie van BMDM’s gekleurd met wild-type (A) en Fc Silent™ (B) anti-F4/80 (Ab00106-8.1 en Ab00106-8.4) en isotype controle antilichamen, gevolgd door fluorescent geconjugeerd geiten anti-rat secundair antilichaam. Het gebruik van Fc Silent™ elimineert niet-specifieke FcγR-gedreven kleuring, waardoor de gegevens schoner en nauwkeuriger worden. Klik hier voor meer informatie.
Figuur 2A en B. Sensogram met binding van muis wild-type en Fc Silent™ anti-F4/80 IgG2a monoklonale antilichamen (Ab00106-2.0 en Ab00106-2.3, respectievelijk) aan geïmmobiliseerde Fcγ-receptoren met lage en hoge affiniteit van de muis (CD16, CD16-2, CD32, CD64). Biacore SPR bindingsanalyse toont aan dat het Fc Silent™ antilichaam zijn vermogen tot interactie met de muis Fc receptoren heeft verloren.
Figuur 2C en D. Sensogram toont binding van rat wild-type en Fc Silent™ anti-F4/80 monoklonale antilichamen (Ab00106-8.1 en Ab00106-8.4, respectievelijk) aan geïmmobiliseerde muis lage en hoge affiniteit Fcγ receptoren (CD16, CD16-2, CD32, CD64). Biacore SPR bindingsanalyse toont aan dat het Fc Silent™ antilichaam zijn vermogen tot interactie met de muis Fc receptoren heeft verloren.
Figuur 2E. Directe competitieve inhibitie ELISA. 2µg/ml/well van menselijke recombinante FcγR1-receptor (rCD64) werd geabsorbeerd op een 96-well-plaat. 40 µg/ml gebiotinyleerd Alemtuzumab (Campath) werd voorgemengd met ongelabelde serieel verdunde murine wild-type of Fc Silent™ anti-F4/80 IgG2a monoklonale antilichamen (respectievelijk Ab00106-2.0 of Ab00106-2.3) of Alemtuzumab (Campath; positieve controle). De gegevens tonen duidelijk aan dat het Fc Silent™ antilichaam, Ab00106-2.3, niet bindt aan de menselijke Fc-receptor.