Het aantal microtubuli dat aan één kinetochore vastzit, varieert: in Saccharomyces cerevisiae bindt slechts één MT aan elke kinetochore, terwijl er in zoogdieren 15-35 MT’s aan elke kinetochore kunnen zijn gebonden. Niet alle MT’s in de spindel hechten echter aan één kinetochore. Er zijn MT’s die zich uitstrekken van het ene centrosoom naar het andere (en die verantwoordelijk zijn voor de lengte van de spindel) en sommige kortere MT’s zijn onderling verbonden tussen de lange MT’s. Professor B. Nicklas (Duke University) toonde aan dat, als men de aanhechting van de MT-kinetochore met een laserstraal afbreekt, de chromatiden niet meer kunnen bewegen, hetgeen leidt tot een abnormale chromosoomverdeling. Deze experimenten toonden ook aan dat kinetochoren polariteit hebben, en dat de aanhechting van kinetochoren aan MT’s die van het ene of het andere centrosoom afkomstig zijn, afhankelijk is van de oriëntatie. Deze specificiteit garandeert dat slechts één chromatide naar elke spindelzijde zal bewegen, waardoor de juiste verdeling van het genetisch materiaal wordt gewaarborgd. Een van de basisfuncties van de kinetochore is dus de MT-bevestiging aan de spindel, die essentieel is voor een correcte segregatie van de zusterchromatiden. Als de verankering niet correct is, kunnen er fouten ontstaan, waardoor aneuploïdie ontstaat, met catastrofale gevolgen voor de cel. Om dit te voorkomen zijn er mechanismen voor foutdetectie en -correctie (zoals het controlepunt voor de assemblage van de spoel), waarvan de componenten zich ook op de kinetochores bevinden. De beweging van één chromatide naar het centrosoom wordt voornamelijk veroorzaakt door MT-depolymerisatie in de bindingsplaats met de kinetochore. Deze bewegingen vereisen ook het genereren van kracht, waarbij moleculaire motoren betrokken zijn die zich eveneens op de kinetochoren bevinden.
Verankering van chromosomen aan MT’s in de mitotische spindelEdit
Vastleggen van MT’sEdit
Tijdens de synthesefase (S-fase) in de celcyclus begint het centrosoom zich te dupliceren. Net aan het begin van de mitose bereiken beide centriolen in elk centrosoom hun maximale lengte, centrosomen rekruteren extra materiaal en hun nucleatiecapaciteit voor microtubuli neemt toe. Naarmate de mitose vordert, scheiden beide centrosomen zich om de mitotische spindel te vormen. Op die manier heeft de spil in een mitotische cel twee polen die microtubuli uitzenden. Microtubuli zijn lange proteïsche filamenten met asymmetrische uitersten, een “min”-(-) uiteinde dat relatief stabiel is naast het centrosoom, en een “plus”-(+) uiteinde dat afwisselend fasen van groeien en krimpen doorloopt, waarbij het centrum van de cel wordt verkend. Tijdens dit zoekproces kan een microtubule via de kinetochore een chromosoom tegenkomen en vastgrijpen. Microtubuli die een kinetochore vinden en vastmaken, worden gestabiliseerd, terwijl microtubuli die vrij blijven, snel worden gedepolymeriseerd. Aangezien chromosomen twee kinetochores hebben die rug-aan-rug met elkaar zijn verbonden (één op elk zustercromatide), wordt, wanneer één van hen zich vasthecht aan de microtubuli die door één van de celpolen worden gegenereerd, de kinetochore op het zustercromatide blootgesteld aan de tegenoverliggende pool; Daarom wordt de tweede kinetochore meestal vastgemaakt aan de microtubuli die van de tegenoverliggende pool afkomstig zijn, zodat de chromosomen nu twee-georiënteerd zijn, één fundamentele configuratie (ook amphitelisch genoemd) om de correcte scheiding van beide chromatiden bij de celdeling te verzekeren.
Wanneer slechts één microtubule aan één kinetochore wordt verankerd, zet dit een snelle beweging in gang van het bijbehorende chromosoom naar de pool die die microtubule genereert. Deze beweging wordt waarschijnlijk gemedieerd door de motoractiviteit naar de “min” (-) van het motoreiwit cytoplasmatische dyneïne, dat zeer geconcentreerd is in de kinetochoren die niet aan MT’s verankerd zijn. De beweging in de richting van de pool wordt vertraagd tot kinetochoren kMT’s (aan kinetochoren verankerde MT’s) krijgen en de beweging wordt gestuurd door veranderingen in de lengte van de kMT’s. Dyneïne komt vrij van kinetochoren wanneer deze kMT’s verwerven en is in gekweekte zoogdiercellen vereist voor de inactivering van het spindelcontrolepunt, maar niet voor chromosoomcongregatie in de evenaar van de spindel, verwerving van kMT’s of anafase A tijdens chromosoomsegregatie. In hogere planten of in gist is er geen bewijs voor dyneïne, maar andere kinesinesines aan het (-) uiteinde zouden het ontbreken van dyneïne kunnen compenseren.
Een ander motoreiwit dat betrokken is bij de initiële vangst van MTs is CENP-E; dit is een kinesine met een hoog moleculair gewicht dat geassocieerd is met de vezelige corona bij zoogdieren kinetochores van prometafase tot anafase. In cellen met een laag gehalte aan CENP-E missen chromosomen dit eiwit bij hun kinetochores, waardoor zij vaak niet in staat zijn om bij de metafaseplaat samen te komen. In dit geval kunnen sommige chromosomen chronisch mono-georiënteerd blijven (verankerd aan slechts één pool), hoewel de meeste chromosomen correct aan de metafaseplaat kunnen congresseren.
Het wordt algemeen aangenomen dat de kMTs vezel (de bundel van microtubuli gebonden aan de kinetochore) ontstaat door de vangst van MTs gepolymeriseerd aan de centrosomen en de spoelpolen in gekweekte cellen van zoogdieren. Maar MTs die direct aan de kinetochoren gepolymeriseerd zijn, zouden ook een belangrijke bijdrage kunnen leveren. De manier waarop het centromerische gebied of de kinetochore de vorming van kMTs initieert en de frequentie waarmee dit gebeurt zijn belangrijke vragen, omdat dit mechanisme niet alleen kan bijdragen aan de initiële vorming van kMTs, maar ook aan de manier waarop kinetochores defecte verankering van MTs corrigeren en de beweging langs kMTs reguleren.
Rol van Ndc80 complexEdit
MT’s die aan kinetochores zijn geassocieerd vertonen bijzondere kenmerken: vergeleken met vrije MT’s zijn kMT’s veel beter bestand tegen koude-geïnduceerde depolymerisatie, hoge hydrostatische druk of blootstelling aan calcium. Bovendien worden kMT’s veel langzamer gerecycled dan astrale MT’s en spindel MT’s met vrije (+) uiteinden, en als kMT’s met een laserstraal van kinetochoren worden losgemaakt, depolymeriseren ze snel.
Toen duidelijk werd dat dyneïne noch CENP-E essentieel is voor de vorming van kMT’s, zouden andere moleculen verantwoordelijk moeten zijn voor de stabilisatie van kMT’s. Pionier genetisch werk in gist onthulde de relevantie van het Ndc80 complex in kMTs verankering. In Saccharomyces cerevisiae bestaat het Ndc80-complex uit vier componenten: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p en Spc25p. Mutanten die een van de componenten van dit complex missen, vertonen verlies van de kinetochore-microtubule verbinding, hoewel de kinetochorestructuur niet volledig verloren gaat. Mutanten waarin de kinetochorestructuur verloren gaat (bijvoorbeeld Ndc10 mutanten in gist) zijn echter deficiënt in zowel de verbinding met microtubuli als in het vermogen om het spindelcontrolepunt te activeren, waarschijnlijk omdat kinetochores werken als een platform waarin de componenten van de reactie worden geassembleerd.
Het Ndc80 complex is zeer geconserveerd en het is geïdentificeerd in S. pombe, C. elegans, Xenopus, kip en mens. Studies over Hec1 (highly expressed in cancer cells 1), de humane homoloog van Ndc80p, tonen aan dat het belangrijk is voor een correcte chromosoomcongressie en mitotische progressie, en dat het interageert met componenten van de cohesine- en condensinecomplexen.
Verschillende laboratoria hebben aangetoond dat het Ndc80 complex essentieel is voor de stabilisatie van de kinetochore-microtubule verankering, die nodig is om de centromerische spanning te ondersteunen die betrokken is bij het tot stand komen van de juiste chromosoom-congressie in hoge eukaryoten. Cellen met een verminderde functie van Ndc80 (met behulp van RNAi, gen knock-out, of antilichaam micro-injectie) hebben abnormaal lange spindels, gebrek aan spanning tussen de zuster kinetochores, chromosomen niet in staat om samen te komen op de metafase plaat en weinig of geen geassocieerde kMTs.
Er is een verscheidenheid aan sterke ondersteuning voor het vermogen van het Ndc80 complex om direct te associëren met microtubuli en de kern geconserveerd component van de kinetochore-microtubule interface te vormen. Echter, de vorming van robuuste kinetochore-microtubule interacties kan ook de functie van andere eiwitten vereisen. In gist vereist deze verbinding de aanwezigheid van het complex Dam1-DASH-DDD. Sommige leden van dit complex binden direct aan MT’s, terwijl andere zich binden aan het Ndc80-complex. Dit betekent dat het complex Dam1-DASH-DDD een essentiële adapter zou kunnen zijn tussen kinetochores en microtubuli. In dieren is echter geen equivalent complex geïdentificeerd, en deze vraag wordt nog steeds intensief onderzocht.
Verificatie van kinetochore-MT verankeringEdit
Tijdens de S-fase dupliceert de cel alle genetische informatie die is opgeslagen in de chromosomen, in het proces dat DNA replicatie wordt genoemd. Aan het eind van dit proces bevat elk chromosoom twee zusterchromatiden, die twee volledige en identieke DNA-moleculen zijn. Beide chromatiden blijven geassocieerd door cohesinecomplexen tot de anafase, wanneer chromosoomsegregatie plaatsvindt. Als de chromosoomsegregatie correct verloopt, ontvangt elke dochtercel een volledige set chromatiden, en om dit te laten gebeuren moet elk zusterchromatide verankeren (via de overeenkomstige kinetochore) aan MT’s die in tegengestelde polen van de mitotische spindel zijn gegenereerd. Deze configuratie wordt amphitelisch of bi-oriëntatie genoemd.
Tijdens het verankeringsproces kunnen echter ook enkele onjuiste configuraties ontstaan:
- monotelisch: slechts een van de chromatiden is verankerd aan MT’s, de tweede kinetochore is niet verankerd; in deze situatie is er geen centromerische spanning en wordt het spindelcontrolepunt geactiveerd, waardoor de start in de anafase wordt vertraagd en de cel de tijd krijgt om de fout te corrigeren. Als de fout niet wordt gecorrigeerd, kan het niet-verankerde chromatide in een van de twee dochtercellen willekeurig eindigen, waardoor aneuploïdie ontstaat: de ene dochtercel heeft een teveel aan chromosomen en de andere heeft een tekort aan chromosomen.
- syntelisch: beide chromatiden zijn verankerd aan MT’s die van dezelfde pool afkomstig zijn; ook in deze situatie ontstaat geen centromerische spanning, en het spindelcontrolepunt wordt geactiveerd. Als dit niet wordt gecorrigeerd, zullen beide chromatiden in dezelfde dochtercel eindigen, waardoor aneuploïdie ontstaat.
- merotelisch: ten minste één chromatide is tegelijkertijd verankerd aan MT’s die van beide polen uitgaan. Deze situatie genereert centromerische spanning, en om deze reden wordt het spindelcontrolepunt niet geactiveerd. Als dit niet wordt gecorrigeerd, zal het chromatide dat aan beide polen is gebonden als een achterblijvend chromosoom in de anafase blijven bestaan, en uiteindelijk in twee fragmenten worden gebroken, die over de dochtercellen worden verdeeld, waardoor aneuploïdie ontstaat.
Zowel de monotelische als de syntelische configuratie genereren geen centromerische spanning en worden gedetecteerd door het spindelcontrolepunt. De merotelische configuratie wordt daarentegen niet door dit controlemechanisme gedetecteerd. De meeste van deze fouten worden echter gedetecteerd en gecorrigeerd voordat de cel in anafase gaat. Een sleutelfactor in de correctie van deze verankeringsfouten is het chromosomale passagierscomplex, dat het kinase-eiwit Aurora B, zijn doel- en activerende subeenheid INCENP en twee andere subeenheden, Survivin en Borealin/Dasra B, omvat (besproken door Adams en medewerkers in 2001). Cellen waarin de functie van dit complex is uitgeschakeld door dominant negatieve mutanten, RNAi, micro-injectie van antilichamen of het gebruik van selectieve geneesmiddelen, stapelen zich fouten op in de chromosoomverankering. Vele studies hebben aangetoond dat Aurora B nodig is om onjuiste verankering van kinetochore-MT te destabiliseren, wat het ontstaan van amphitelische verbindingen bevordert. Aurora B homoloog in gist (Ipl1p) fosforileert sommige kinetochore eiwitten, zoals het constitutieve eiwit Ndc10p en leden van de Ndc80 en Dam1-DASH-DDD complexen. Fosforylering van Ndc80 complex componenten leidt tot destabilisatie van kMTs verankering. Er is voorgesteld dat de lokalisatie van Aurora B belangrijk is voor zijn functie: omdat het zich in de binnenste regio van de kinetochore bevindt (in het centromerische heterochromatine), scheiden de zusterkinetochores zich wanneer de centromerische spanning tot stand komt, en kan Aurora B zijn substraten niet bereiken, zodat kMT’s gestabiliseerd worden. Aurora B komt veelvuldig tot overexpressie in verschillende soorten kanker, en het is momenteel een doelwit voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker.
Spindle checkpoint activationEdit
Het spindle checkpoint, of SAC (voor spindle assembly checkpoint), ook wel mitotic checkpoint genoemd, is een cellulair mechanisme dat verantwoordelijk is voor de detectie van:
- correcte assemblage van de mitotische spindel;
- hechting van alle chromosomen aan de mitotische spindel op een bipolaire manier;
- congressie van alle chromosomen op de metafaseplaat.
Wanneer één chromosoom (om welke reden dan ook) tijdens de congressie achterblijft, genereert de spindelcontrolepost een vertraging in de voortgang van de celcyclus: de cel wordt gearresteerd, zodat reparatiemechanismen de tijd hebben om het gedetecteerde probleem op te lossen. Na verloop van tijd, als het probleem niet is opgelost, zal de cel worden gericht voor apoptose (geprogrammeerde celdood), een veiligheidsmechanisme om het genereren van aneuploïdie te voorkomen, een situatie die over het algemeen dramatische gevolgen heeft voor het organisme.
Waar structurele centromerische eiwitten (zoals CENP-B) stabiel gelokaliseerd blijven gedurende de mitose (ook tijdens de telofase), worden de componenten van het spindel-checkpoint in hoge concentraties op de kinetochore verzameld in afwezigheid van microtubuli, en hun concentraties nemen af naarmate het aantal microtubuli dat aan de kinetochore is bevestigd toeneemt.
Bij de metafase neemt het gehalte aan CENP-E, Bub3 en Bub1 3 tot 4 keer af ten opzichte van het gehalte aan niet-vastgehechte kinetochoren, terwijl het gehalte aan dyneïne/dynactine, Mad1, Mad2 en BubR1 >10-100 keer afneemt. Dus in de metafase, wanneer alle chromosomen op één lijn liggen op de metafaseplaat, zijn alle controlepunteiwitten losgelaten van de kinetochore. Het verdwijnen van de controlepunteiwitten uit de kinetochoren geeft het moment aan waarop het chromosoom de metafaseplaat heeft bereikt en onder bipolaire spanning staat. Op dat moment laten de controlepunteiwitten die zich binden aan Cdc20 en deze remmen (Mad1-Mad2 en BubR1), Cdc20 los, dat zich bindt en APC/CCdc20 activeert, en dit complex brengt de scheiding van de zusterchromatiden op gang en vervolgens de anafase.
Er zijn verschillende studies die aantonen dat het Ndc80 complex betrokken is bij de regulatie van de stabiele associatie van Mad1-Mad2 en dyneïne met kinetochores. Maar de kinetochore-geassocieerde eiwitten CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H en BubR1 zijn onafhankelijk van Ndc80/Hec1. De verlengde arrestatie in prometafase die wordt waargenomen in cellen met lage Ndc80/Hec1 niveaus hangt af van Mad2, hoewel deze cellen lage niveaus van Mad1, Mad2 en dyneïne op kinetochores vertonen (<10-15% in verhouding tot niet-vastgehechte kinetochores). Echter, als zowel Ndc80/Hec1 als Nuf2 niveaus worden verlaagd, verdwijnen Mad1 en Mad2 volledig van de kinetochores en wordt het spindelcontrolepunt geïnactiveerd.
Shugoshin (Sgo1, MEI-S332 in Drosophila melanogaster) zijn centromerische eiwitten die essentieel zijn om cohesine gebonden te houden aan centromeren tot anafase. Het humane homoloog, hsSgo1, associeert zich met centromeren tijdens de profase en verdwijnt wanneer de anafase begint. Wanneer Shugoshin niveaus worden verlaagd door RNAi in HeLa cellen, kan cohesine niet op de centromeren blijven tijdens mitose, en bijgevolg scheiden de zusterchromatiden synchroon voordat de anafase begint, wat een lange mitotische stilstand veroorzaakt.
Aan de andere kant hebben Dasso en medewerkers ontdekt dat eiwitten die betrokken zijn bij de Ran-cyclus kunnen worden gedetecteerd op kinetochores tijdens mitose: RanGAP1 (een GTPase-activerend eiwit dat de omzetting van Ran-GTP in Ran-GDP stimuleert) en het Ran-bindende eiwit genaamd RanBP2/Nup358. Tijdens de interfase bevinden deze eiwitten zich op de kernpoorten en nemen zij deel aan het nucleo-cytoplasmatisch transport. Kinetochore-lokalisatie van deze eiwitten lijkt functioneel van belang te zijn, omdat sommige behandelingen die het niveau van Ran-GTP verhogen de kinetochore-vrijgave van Bub1, Bub3, Mad2 en CENP-E inhiberen.
Orc2 (een eiwit dat behoort tot het origin recognition complex -ORC- dat betrokken is bij de initiatie van DNA replicatie tijdens de S fase) is ook gelokaliseerd bij kinetochores tijdens mitose in menselijke cellen; in overeenstemming met deze lokalisatie blijkt uit sommige studies dat Orc2 in gist betrokken is bij de cohesie van de zusterchromatiden, en dat wanneer het uit de cel wordt verwijderd, activering van het spindel checkpoint volgt. Sommige andere ORC-componenten (zoals orc5 in S. pombe) blijken ook bij de cohesie betrokken te zijn. ORC-eiwitten lijken echter deel te nemen aan een moleculaire route die additief is aan de cohesineprocedure, en deze is grotendeels onbekend.
Krachtopwekking om chromosoombeweging voort te stuwenEdit
De meeste chromosoombewegingen ten opzichte van de spindelpolen zijn geassocieerd met het verlengen en verkorten van kMTs. Een van de meest interessante eigenschappen van kinetochoren is hun vermogen om de toestand van hun geassocieerde kMTs (ongeveer 20) te wijzigen van een depolymerisatietoestand aan hun (+) uiteinde in een polymerisatietoestand. Hierdoor kunnen de kinetochoren van cellen in de prometafase “directionele instabiliteit” vertonen, waarbij ze wisselen tussen hardnekkige fasen van beweging naar de pool toe (poleward) of omgekeerd (anti-poleward), die gepaard gaan met afwisselende toestanden van respectievelijk depolymerisatie en polymerisatie van de kMT’s. Deze bi-stabiliteit van de kinetochore lijkt deel uit te maken van een mechanisme om de chromosomen aan de evenaar van de spindel uit te lijnen zonder de mechanische verbinding tussen kinetochores en spindelpolen te verliezen. Aangenomen wordt dat de bi-stabiliteit van de kinetochore berust op de dynamische instabiliteit van het kMT-(+)-uiteinde, en gedeeltelijk wordt gecontroleerd door de spanning die op de kinetochore aanwezig is. In gekweekte zoogdiercellen bevordert een lage spanning op de kinetochoren verandering in de richting van kMTs depolymerisatie, en een hoge spanning verandering in de richting van kMTs polymerisatie.
Kinetochore eiwitten en eiwitten die binden aan MTs (+) uiteinde (gezamenlijk +TIPs genoemd) reguleren de beweging van de kinetochore door de dynamiek van het kMTs (+) uiteinde te reguleren. Het raakvlak tussen kinetochore en microtubuli is echter zeer dynamisch, en sommige van deze eiwitten lijken bonafide componenten te zijn van beide structuren. Twee groepen van eiwitten lijken bijzonder belangrijk te zijn: kinesinesines die werken als depolymerases, zoals KinI kinesinesines; en eiwitten gebonden aan MT (+) uiteinden, +TIPs, die polymerisatie bevorderen, misschien het depolymerase effect tegenwerken.
- KinI kinesinesines heten “I” omdat ze een intern motordomein hebben, dat ATP gebruikt om depolymerisatie van tubulinepolymeer, de microtubule, te bevorderen. In vertebraten is MCAK de belangrijkste KinI kinesine die de dynamiek van de (+) eindassemblage controleert. Het lijkt er echter op dat er nog andere kinesinesines bij betrokken zijn.
- Er zijn twee groepen +TIPs met kinetochore functies.
- De eerste omvat het eiwit adenomateuze polyposis coli (APC) en het geassocieerde eiwit EB1, die MT’s nodig hebben om op de kinetochores te lokaliseren. Beide eiwitten zijn nodig voor een correcte chromosoomsegregatie. EB1 bindt alleen aan MTs in polymeriserende toestand, wat suggereert dat het de kMTs stabilisatie tijdens deze fase bevordert.
- De tweede groep +TIPs omvat eiwitten die zelfs in afwezigheid van MTs op kinetochores kunnen lokaliseren. In deze groep zijn er twee eiwitten die veel bestudeerd zijn: CLIP-170 en hun geassocieerde eiwitten CLASPs (CLIP-geassocieerde eiwitten). De rol van CLIP-170 op kinetochores is onbekend, maar expressie van een dominant negatieve mutant veroorzaakt een prometafase vertraging, wat suggereert dat het een actieve rol heeft in de uitlijning van chromosomen. CLASPs eiwitten zijn nodig voor chromosoom uitlijning en behoud van een bipolaire spindel in Drosophila, mensen en gist.