METHODEN
Het is een cross-sectionele studie uitgevoerd voor de evaluatie van ABH-afscheiders en niet-afscheiders bij de bevolking van Karachi (Pakistani). Honderd en één gezonde volwassen studenten (76 mannen, 25 vrouwen) tussen 15 en 40 jaar oud werden willekeurig geselecteerd voor deze studie. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle individuen. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Baqai Medical University, Karachi. Tien ml speeksel werd verzameld in gesteriliseerde plastic wegwerpcontainers van alle personen. Vijf ml (2 ml in een EDTA-buis en 3 ml in een niet-geanestreerde buis) bloed werd aseptisch afgenomen bij alle personen voor cel- en serumgroepering.
ABO- en Rh-bloedgroeperingsprocedure:
Bereiding van 3% rode-celsuspensie: Twee ml bloed verzameld in een EDTA anti-coagulatie buis werd gecentrifugeerd bij lage snelheid (1500 rpm) gedurende 3 minuten. Plasma werd overgebracht in een andere buis en gebruikt voor serumgroepering. De buis met cellen werd gevuld met normale zoutoplossing. De buisjes werden goed gemengd en opnieuw gecentrifugeerd bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 3 minuten. De wasprocedure werd tweemaal herhaald. Tijdens het laatste wassen werd het buisje gedurende 3 minuten op hoge snelheid (3000 rpm) gecentrifugeerd en werd het supernatans weggegooid. Transparant supernatant en het verschijnen van een celspoorlijn wijzen op een correcte celdosering.
I: Groepering van cellen: Drie schone glazen reageerbuisjes werden gelabeld als buis A voor anti A, buis B voor anti B en buis D voor anti D. Eén druppel antiserum werd toegevoegd als Anti A sera aan buis A, anti B sera aan buis B en anti D sera aan buis D. Eén druppel 3% rode celsuspensie werd toegevoegd aan buis A, buis B en buis D. Alle inhoud werd goed gemengd. Alle buisjes werden onmiddellijk gecentrifugeerd bij 3400 omwentelingen per minuut gedurende 15 seconden. Alle buisjes werden er voorzichtig uitgehaald en de buisjes werden afzonderlijk op agglutinatie onderzocht.
II: Serumgroepering: Serum werd gescheiden van niet-geaguleerde buis na centrifugatie gedurende 5 minuten bij 3000rmp. Drie schone glazen reageerbuisjes werden gelabeld als buis “a” voor A-cellen, buis “b” voor B-cellen en “o” voor O-cellen. Aan elk buisje werden twee druppels individueel serum toegevoegd. Eén druppel bekende 3% rode celsuspensie van A-, B- en O-cellen werd toegevoegd aan de buizen “a”, “b” en “o”. De inhoud van alle buisjes werd goed gemengd en onmiddellijk gedurende 15 seconden gedraaid.
Alle monsters werden binnen 6 uur getest, met gebruikmaking van verse rode-celsuspensie van dezelfde persoon. Verzameling en verwerking van speeksel: Van alle personen werd 10 ml speeksel verzameld in een gesteriliseerde plastic wegwerpcontainer en uit de container overgebracht in een gesteriliseerde glazen wegwerpbuis. De buis met speeksel werd gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 10 minuten. Het supernatant werd overgebracht in een ander glazen buisje. De buis met het supernatant van het speeksel werd gedurende 30 minuten in een waterbad van 56oC geplaatst om de speekselamylase te inactiveren. De monsterbuis werd afgekoeld en gedurende 10 minuten opnieuw gecentrifugeerd bij 2000 rpm. Het supernatant werd overgebracht in een andere wegwerp-testbuis en gebruikt voor de hemagglutinatieremmingstest of neutralisatietest.
Principe van hemagglutinatieremmingstest: ABH-stoffen die in oplosbare vorm in vloeistoffen (bv. speeksel) aanwezig zijn, neutraliseren hun overeenkomstige antilichamen. De antilichamen zullen niet langer in staat zijn rode cellen te agglutineren die dezelfde antigenen bezitten.11,12
Hemagglutinatieremmingstestprocedure:
Voorbereiding van de bloedgroepantisera verdubbelingsverdunningen: Tien reageerbuisjes werden in een rek geplaatst met etiketten volgens de titer, d.w.z. 1:2 (buis 1), 1:4 (buis 2), tot 1:1024 (buis 10). Aan alle buisjes werd tweehonderd microliter zoutoplossing toegevoegd. Aan buis 1 werd 200 µl antisera toegevoegd en goed gemengd. Tweehonderd µl van de verdunningen van buis 1 werd overgebracht naar buis 2 en goed gemengd. Dezelfde procedure werd herhaald van buisje 2 tot buisje 10. Tweehonderd µl verdund antiserum werd weggegooid uit buis 10. Elke buis bevatte een gelijke hoeveelheid antisera en zoutoplossing. Deze verdubbelingsverdunning werd gebruikt in de agglutinatieremmingstest
Drie rijen van 10 reageerbuisjes werden in een rekje geplaatst met het volgende opschrift: I: Dubbele verdunning (D/D) buizen II: Controle buizen (Titratie buizen) III: Test buizen (Inhibitie buizen).
Dubbele verdunning van groep specifieke antisera werd bereid in rij I. Elke buis werd geëtiketteerd volgens de titer d.w.z. 1:2 (buis1), 1:4 (buis2) tot en met 1:1024 (buis10). Honderd µl bloedgroep-specifiek antiserum van elke verdunning werd overgebracht naar de corresponderend geëtiketteerde buisjes in de rijen II en III, zoals aangegeven in tabel I. Honderd µl zoutoplossing werd toegevoegd aan elk buisje in rij II. Aan elk buisje van rij III werd honderd µl speeksel toegevoegd. Alle buisjes van rij II en III werden afgedekt en goed gemengd. Deze buisjes werden bij 37°C gedurende 30 minuten in een waterbad geïncubeerd onder geregeld schudden. Na de incubatie werd aan elk buisje van rij II en III 100 µl 3% groepsspecifieke rode-celsuspensie toegevoegd en goed gemengd. Alle buisjes werden gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Alle buisjes werden macroscopisch op agglutinatie geobserveerd onder een goede lichtbron.
Interpretatie van de resultaten:
-
Positieve secretorstatus:
Macroscopische agglutinatie bij een hogere titer (1:128) in de controle (rij II) en een lagere titer (1:16) in de test (rij III) duidde op de aanwezigheid van bloedgroepstoffen in het testspeeksel.
-
Negatieve secretor status:
Geen verschil in de titer waarbij agglutinatie zichtbaar werd in beide rijen impliceerde de afwezigheid van bloedgroepspecifieke stoffen in het speeksel om het antiserum te neutraliseren.13
Statistische analyse: Statistical package for social sciences (SPSS) versie 17 werd gebruikt voor de analyse van de gegevens. Beschrijvende statistiek werd gebruikt voor de berekening van frequentie en percentages.