VI Making the Pyloric Sphincter
Studies naar de ontwikkeling van de pyloric sphincter hebben zich grotendeels geconcentreerd op muriene en aviaire modellen. De maag van de muis vertoont de typische zoogdieren voordarm morfologie waarin de pariëtale cel-bevattende corpus is anterior aan een slijm-secreting antrum. Bij het kuiken daarentegen is de proventriculus het voorste kliergebied. Een functioneel unieke spiermaag vormt de achterste maag, maar het drukt veel van dezelfde genetische markers als de zoogdieren antrum.82-84 De pyloric regio in het kuiken heeft een unieke epitheel, die verschilt van die van de omringende spiermaag of de darm. Bij de muis zijn er echter geen opmerkelijke morfologische verschillen in het epitheel dat het antrum scheidt van de pylorus. Ondanks deze duidelijke variaties in GI tract morfologie, lijkt het genetische netwerk van pylorus en distale maag ontwikkeling goed geconserveerd tussen de twee species.82
Een van de vroegste markers van de pyloric grondgebied is Nkx2-5. Expressie van dit homeobox-gen wordt voor het eerst waargenomen in de bilaterale condensaties van de splanchnische mesodermale plaat op E9.5.21 Door E10.5, Nkx2-5 expressie duidelijk scheidt een ring van mesoderm net distaal van de maag, op de plaats van de toekomstige pylorus. Expressie van Nkx2-5 op deze kruising tussen de darm en de maag wordt gezien bij vogels, muizen, volwassen kikkers, en kikkervisjes (ondanks het feit dat kikkervisjes een slecht afgebakende maag en geen pylorische sluitspier hebben).82 Hoewel het domein van Nkx2-5 kleuring is iets breder in kikkervisjes in vergelijking met volwassen kikkers (het is iets naar voren uitgebreid), het feit dat deze marker wordt uitgedrukt, zelfs in de afwezigheid van een pyloric sluitspier, suggereert dat Nkx2-5 kan worden het spelen van patroon rollen onafhankelijk van zijn mogelijke rol in de ontwikkeling van de sluitspier per se. Aangezien Nkx2-5-nul muisembryo’s zeer vroeg sterven aan hartafwijkingen,85 moet de deelname van Nkx2-5 aan de morfogenese van de sluitspier of aan patroonvorming in het algemeen met een conditionele benadering worden geanalyseerd.
In het kuiken bevindt het expressiedomein van Nkx2-5 zich bij de pylorus en overlapt het met het domein voor de Bmp-receptoren, Bmpr1b en Bmpr1a.83 Bmp4, één van de liganden voor deze receptoren, is uitgesloten van de spiermaag en de pylorus, maar komt tot expressie in het aangrenzende intestinale mesoderm. Ectopische expressie van Bmp4 of zijn receptoren in de spiermaag verbreedt het domein van Nkx2-5 expressie83 , terwijl ectopische expressie van noggin dit domein verkleint.83,84 Bovendien activeert overexpressie van de Bmp-receptoren Nkx2-5 op een celautonome manier. Ectopische expressie van Bmp4 verandert ook het karakter van het spiermaag epitheel om te lijken op dat van de pylorische regio.84 Interessant is dat dit gebeurt zonder veranderingen in de expressie van maag markers (Sox2 en Barx1), intestinale markers (CdxA en Nkx2.3), of markers van de hele regio (Pdx1). Deze vroege studies suggereerden dat Bmp4 (die stroomafwaarts van Shh signalen van het endoderm komt) direct verantwoordelijk is voor het patroon van Nkx2-5 expressie in de pylorus en dat Nkx2-5 op zijn beurt signalen activeert die terug praten naar het epitheel om het karakter te bepalen.
Naast de activatie van Nkx2-5, activeert BMP pathway activiteit ook Sox9 expressie in het pylorische mesenchym op een cel-autonome manier.83,86 Interessant is dat misexpressie van Nkx2-5 geen effect heeft op de expressie van Sox9 (en vice versa), wat suggereert dat de activering van elk van deze factoren door BMP via onafhankelijke routes verloopt.86,87 Het endoderm van de spiermaag kan omgezet worden in pylorisch-type epitheel door misexpressie van dominant-negatieve vormen van Nkx2-5 (enrepNkx2-5) of Sox9 (Sox9DCter), hoewel de epitheliale omzetting door enrepNkx2-5 op deze manier onvolledig is,83,87 wat suggereert dat Nkx2-5 niet voldoende is om de pylorische regio te specificeren. Interessant is dat misexpressie van Gremlin in het spiermaesoderm een vergelijkbaar epitheliaal fenotype oplevert als Bmp4, Bmpr1b, Nkx2-5, of Sox9 misexpressie, wat suggereert dat Nkx2-5 en/of Sox9 pylorisch epitheel indirect kunnen specificeren door regulatie van Gremlin expressie.87 Ter ondersteuning van deze hypothese, misexpressie van Sox9 of Sox9DCter in maag mesoderm vergroot of verkleint Gremlin expressie, respectievelijk. Omdat Nkx2-5 Sox9 niet reguleert en de relatie tussen Nkx2-5 en Gremlin onduidelijk is, blijft het mechanisme waarmee Nkx2-5 het pylorus epitheliale fenotype controleert onopgelost.
Een ander molecuul waarvan bekend is dat het belangrijk is voor de ontwikkeling van de pylorus is Barx1, hierboven genoemd als een homeobox domein eiwit dat geactiveerd wordt in het mesenchym onder Sox2 positieve laesies in Cdx2-null cellen. Bij de muis komt Barx1 tot expressie in het gehele mesenchym van de maag van het vroege embryo, maar is afwezig in de maag van de pasgeborene en de volwassene.26,33 In Barx1-nul neonatale dieren (die moeten worden gegenereerd op een gemengde achtergrond om te overleven voorbij E12), is Cdx2 expressie anterieur uitgebreid, hoewel een scherpe anterior expressie grens van Cdx2 expressie nog steeds wordt waargenomen.26Pdx1 is ook uitgebreid, zodanig dat de anterieure grens grenst aan de squameuze forestomach, alsof de corpus ontbreekt of afgekapt. De pyloric sfincter ontbreekt volledig in Barx1 null dieren, en zoals hierboven besproken, is de hypothese dat dit te wijten is aan verhoogde Wnt signalering in de maag na inductie van de Wnt remmers Sfrp1 en Sfrp2.33
Barx1 is ook nodig voor de morfogenese van de milt, maar in dit geval, is de rol niet het antagonisme van Wnt signalering.26 Integendeel, verlies van Barx1 vermindert Wt1 expressie in de milt. Wt1 komt tot expressie in het mesothelium en het mesenchym van de milt en het verlies ervan, net als het verlies van Barx1, resulteert in een kleinere milt die niet goed gescheiden is van de pancreas. Echter, in tegenstelling tot de situatie in Bapx1-nulle muizen zoals hierboven beschreven, resulteert deze voortdurende associatie met de pancreas in Barx1-nulle dieren niet in metaplastische gezwellen in de pancreas.26 Aangezien deze metaplastische laesies kunnen worden geproduceerd in wild-type associaties van milt en pancreas in vitro, lijkt het onwaarschijnlijk dat zij afhankelijk zijn van een uniek aspect van het Bapx1-nul fenotype en is het waarschijnlijker dat de Barx1-nul dieren bepaalde signalen missen die de ontwikkeling van dergelijke structuren mogelijk maken.
Net als Barx1 en Nkx2-5, is Bapx1 (Nkx2-3) een kritische speler in zowel milt- als pylorische morfogenese. Bapx1 wordt iets later geactiveerd dan Barx1 en Nkx2-5 en wordt bij kuikens eerst gezien in het linker laterale mesoderm en later in de vermoedelijke spiermaag, waar het zich geleidelijk concentreert naast de pylorus.88 In kuikenembryo’s remt ectopische expressie van Bapx1 de expressie van Bmp4 en Wnt5a in de proventriculus en zet het epitheel en mesenchym van de proventriculus om in spiermaag-achtige morfologie.88 Daarom wordt verondersteld dat Bapx1 in de spiermaag Bmp4 en Wnt5a in deze regio onderdrukt en inderdaad, expressie van een vorm van Bapx1 die gekoppeld is aan de engrailed repressor resulteert in ectopische activering van Bmp4 en Wnt5a in de spiermaag. Gedeeltelijke omzetting van proventriculus naar spiermaag wordt ook gezien wanneer een dominant-negatieve vorm van Nkx2-5 wordt uitgedrukt in de proventriculus, maar Bmp4 en Wnt5a expressie zijn niet veranderd in dit geval.83 Bovendien heeft ectopische Bapx1 geen invloed op de expressie van Nkx2-5, Barx1, of Pdx1, wat suggereert dat het niet upstream van deze factoren is.88
Bij de muis komt Bapx1 tot expressie in het voormaag op E10.5, met een scherpe voorste grens op de overgang tussen het voormaag en het corpus; later breidt de expressie zich uit tot het grootste deel van de maag, hoewel de expressie op een laag niveau is. Gerichte verstoring van Bapx1 resulteert in verlies van de pylorische vernauwing (misvorming van de pylorische sluitspier) en verkorting van het antrum,27 maar verstoort Nkx2-5 expressie niet. Verzi en collega’s onderzochten muizen dubbelnul voor Bapx1 en Barx1 en vonden dat het fenotype lijkt op dat van het Barx1-nul dier; het corpusgedeelte is meer afgeknot in Barx1-nul dan in Bapx1-nul dieren. Bovendien, terwijl Barx1 expressie niet werd verstoord (of mogelijk verhoogd) in Bapx1-/- muizen, was Bapx1 expressie sterk verminderd in Barx1-nul dieren, tot vaststelling dat Barx1 epistatisch is aan Bapx1 in het ontwikkelende antrum.27
De homeobox transcriptiefactor Six2 is ook gelokaliseerd in de achterste maag. Bij de muis komt Six2 tot expressie vanaf E10,5 tot E14,5, wanneer de expressie aanzienlijk wordt gedownreguleerd en het expressiedomein wordt beperkt tot een gebied net caudaal van de pylorus.28Six2 komt ook tot expressie in de achterste maag van kikker en kuiken, wat erop wijst dat het waarschijnlijk een sleutelcomponent is van het signaalprogramma voor deze regio.82 Six2 mutanten brengen ectopisch Bmp4 tot expressie aan de pylorus; Six2 kan dus verantwoordelijk zijn (misschien samen met Bapx1) voor de downregulatie van Bmp4 in deze regio. Bovendien, de Six2 null dieren vertonen vermindering (maar niet uitsterven) van de expressie van Nkx2-5, Sox9, en Grem1, uitbreiding van het Bmp4 domein in posterior maag mesoderm en een verlies van de pyloric constriction.28Six2, net als Nkx2-5, is een van de vroegste markers van de presumptive pylorus, als zodanig, kan het een belangrijke motor van pyloric morfogenese, maar precies hoe het links in dit ontwikkelingsprogramma is nog niet duidelijk. Het is merkwaardig dat in de muis, de afwezigheid van Six2 ectopische expressie van Bmp4 mogelijk maakt, maar het domein van Nkx2-5 en Sox9 doet krimpen.28 Dit is het tegenovergestelde van wat gezien wordt in het kuiken, waar ectopische Bmp4 het domein van beide genen uitbreidt. Aanvullende studies zijn nodig om deze verschillende reacties te begrijpen. Figuur 5 vat de regulerende interacties samen die de ontwikkeling van de pylorus karakteriseren.
Fig. 5. Vereenvoudigde samenvatting van gen-regulerende interacties die de ontwikkeling van het pylorisch mesenchym karakteriseren. Epitheliale genen zijn boven de lijn weergegeven, terwijl mesenchymale genen onder de lijn staan. Asterisken geven factoren aan waarvan is aangetoond dat ze noodzakelijk zijn voor de ontwikkeling van de pylorische vernauwing. Zie de tekst voor meer informatie.