Guinguette Marais Poitevin

(Bio)degradatiepaden van nitroaromatische explosieven

TNT, dat een positieve Θzz heeft, ondergaat voornamelijk nucleofiele, reductieve (bio)transformaties als gevolg van het elektrofiele karakter van de aromatische kern en het N-atoom van de nitrogroep (Stenuit en Agathos, 2010). C-, N- en H-isotopenfractionering van nitro-aromatische verbindingen in ondergrondse materialen bevestigde dat TNT voornamelijk reductieve omzettingen ondergaat, terwijl de omzetting van 2,4-DNT, dat wordt gekenmerkt door een hogere elektronendichtheid dan TNT, voornamelijk het gevolg is van oxygenatie (Wijker et al., 2013).

Dientengevolge wordt TNT gemakkelijk gereduceerd tot nitroso-, hydroxylamino- en uiteindelijk amino aromatische derivaten via drie opeenvolgende overdrachten van een elektronenpaar (Stenuit en Agathos, 2010). De initiële vier-elektron nitroreductiestap wordt gekatalyseerd door typische NAD(P)H-afhankelijke zuurstofongevoelige (type I) nitroreductases (Stenuit en Agathos, 2010) en type I en type II hydride transferases van de Old Yellow Enzyme (OYE) familie (van Dillewijn et al., 2008). Er is gesuggereerd dat andere enzymen verder betrokken kunnen zijn bij de laatste twee-elektron nitroreductiestap om het aminoareen te vormen (Riefler en Smets, 2002).

Daarnaast is TNT niet onderhevig aan de conventionele elektrofiele aanval door oxygenases. TNT is daarentegen wel gevoelig voor door superoxiden veroorzaakte nucleofiele aanvallen, zoals is waargenomen bij het biomimetische systeem met gereduceerde pyridinenucleotiden en pyocyanine, een redox-actieve metaboliet die wordt afgescheiden door Pseudomonas aeruginosa (Stenuit et al., 2009, Stenuit et al., 2012). Bovendien worden anionische σ-adducten van TNT, ook wel TNT Meisenheimer complexen genoemd, gemakkelijk geproduceerd door covalente bindingsvorming tussen nucleofielen, zoals de negatief geladen vorm van het waterstofatoom, H- (hydride ion), en de aromatische ring van TNT. Tot dusver zijn verschillende enzymen uit bacteriën en planten gekarakteriseerd die de nucleofiele additie van hydride-ionen aan de TNT-aromatische ring katalyseren, waaronder specifieke NAD(P)H-afhankelijke type II OYE hydride transferases (figuur 3(a)) (Beynon et al., 2009, Durchschein et al., 2013) en, in veel mindere mate, specifieke F420-afhankelijke actinomycetale hydride-transferases (Heiss en Knackmuss, 2002). Na de overdracht van hydride-ionen aan de aromatische ring van TNT worden hydride- en dihydride-Meisenheimercomplexen van TNT (respectievelijk -TNT en -TNT) geproduceerd, die verder nitriet en diverse gedenitreerde metabolieten van TNT kunnen opleveren die doorgaans in het reactiemedium accumuleren. Hoewel stikstof uit TNT verder kan worden geassimileerd via de activiteit van nitrietreductase en de glutaminesynthetase-glutamaatsynthase (GS-GOGAT)-route, wordt algemeen vastgesteld dat gedenitreerde metabolieten van TNT niet als koolstofbron kunnen worden gebruikt. Het inherente probleem van de uitgebreide chemische en metabolische omlegging sluit het ontstaan van een unieke nuttige biologische afbraakroute voor TNT uit. Zo kunnen condensatieproducten van TNT-metabolieten worden geproduceerd tussen (i) nitroso- en hydroxylamino-dinitrotolueenisomeren om tetranitroazoxytolueenverbindingen zoals 4,4′,6,6′-tetranitro-2,2′-azoxytolueen te vormen en (ii) hydroxylamino-dinitrotolueenisomeren en geprotoneerde dihydride Meisenheimer complexen van TNT om secundaire diarylamines te vormen (van Dillewijn et al., 2008). TNT-metabolieten die afkomstig zijn van de reductie van het nitromoeder kunnen ook oxidatie van het methylmoeder of acetylering van het aminomoeder ondergaan (Stenuit en Agathos, 2010). Deze diverse verbindingen worden gewoonlijk “doodlopende metabolieten” genoemd omdat zij zich ophopen. Bovendien lijkt de vorming van zelfmoordmetabolieten als gevolg van de toxische effecten van tussenproducten en secundaire producten die worden gegenereerd door de reductie van het nitromotief een belangrijke hinderpaal te zijn voor een productief metabolisme van TNT (Lenke et al., 2000).

Figuur 3. Biologische afbraak van nitro-explosieven gekatalyseerd door (a) sommige leden van de OYE-familie (bijv, PETN-reductase), (b) de F420-afhankelijke reductases van de npd-cluster, en (c) het XplA-XplB-systeem.

Een aantal auteurs heeft echter onlangs gunstige biologische afbraaktrajecten voor TNT gerapporteerd met (i) de productie van de metaboliseerbare verbinding 2,4-dinitrotolueen (2,4-DNT) uit monohydride Meisenheimer-complex van TNT (Stenuit en Agathos, 2010, Ziganshin et al, 2010a,b) en (ii) het bewijs met behulp van stabiele isotopen sondering (SIP) van assimilatie van 15 N en 13C uit TNT in bacterieel DNA (Gallagher et al.,

Ter benutting van de katabole capaciteiten van de gisten Yarrowia lipolytica en Geotrichum candidum en de verzuring van het kweekmedium door de productie van organische zuren, hebben Ziganshin et al. (2010a,b) de transformatie onder zure omstandigheden gerapporteerd (d.w.z, bij een pH < 4,2) van C3–TNT tot 2,4-DNT, een mineraliseerbare TNT-denitraatmetaboliet (Johnson et al,

Met behulp van DNA-SIP en T-RFLP hebben Gallagher et al. (2010) het gebruik van TNT als zowel koolstof- als stikstofbron onder sulfogene omstandigheden gerapporteerd door een Lysobacter taiwanensis-stam die aanvankelijk aanwezig was in anaerobe organisch-rijke estuariene sedimenten. De opname van TNT in de celbiomassa van Lysobacter als primair substraat of als co-substraat (cometabolisme) moet echter nog worden opgehelderd. Hoewel aanvullende experimenten in axenische culturen nodig zijn om de volledige biologische afbraakroutes gekatalyseerd door L. taiwanensis te ontcijferen, biedt de ondubbelzinnige demonstratie van anaerobe bacteriële assimilatie van zowel N als C uit TNT nieuwe veelbelovende saneringsmogelijkheden, zoals bioaugmentatieproeven van anaerobe TNT-gecontamineerde omgevingen.

Hoewel de in de literatuur gerapporteerde biologische afbraaktrajecten van TNT uitsluitend door cometabolisme worden ondersteund, is van specifieke bacteriën van de orde Actinomycetales gemeld dat zij TNP als enige bron van stikstof, koolstof en energie gebruiken zonder reductie van het nitro-gedeelte (bv, picraminezuur, een monoamino derivaat van TNP) (Hofmann et al., 2004). De belangrijkste katabole route van TNP is de enzymatische hydrideoverdracht naar de aromatische kern, gevolgd door opeenvolgende denitreringsreacties en het doorsluizen van gesplitste metabolieten naar de tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus). De gencluster voor de afbraak van TNP (npd-cluster) is gekarakteriseerd, waarbij verschillende inducers en de transcriptionele regulator NpdR zijn geïdentificeerd (Nga et al., 2004). De enzymen die betrokken zijn bij de perifere katabole routes van TNP in Rhodococcus opacus HL PM-1 zijn hydride transferase II (HTII), gecodeerd door npdI, en hydride transferase I (HTI), gecodeerd door npdC, die respectievelijk het monohydride Meisenheimer complex van TNP (-TNP) en het dihydride Meisenheimer complex van TNP (-TNP) produceren (Nga et al., 2004). De activiteit van HTII en HTI is afhankelijk van een NADPH-afhankelijk F420-reductase (NdfR), gecodeerd door npdG, dat fungeert als een elektronenruil tussen NADPH en F420. Zoals afgebeeld in figuur 3(b), wordt de overdracht van hydride van gereduceerd co-enzym F420H2 naar de aromatische ring van TNP gekatalyseerd door HTII/HTI (Nga et al., 2004). In Nocardioides simplex FJ2-1A vinden dezelfde perifere katabole routes van TNP plaats, behalve dat een uniek hydride transferase (HT) de productie van -TNP en -TNP katalyseert (Hofmann et al., 2004). Vervolgens katalyseert het tautomerase NpdH, gecodeerd door npdH, een protonverschuivend tautomerisme van -TNP om de nitrovorm (R2C(- H)NO2) en de aci-nitrovorm (R2C=N+(- O-)OH) in evenwicht te produceren. Deze laatste ondergaat een enzymatische denitreringsreactie gekatalyseerd door celvrije extracten van R. opacus HL PM-1 of N. simplex FJ2-1A (die een wees denitrase bevatten) om het monohydride Meisenheimer complex van 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) te vormen (Hofmann et al., 2004). Na een tweede hydrogenering door het HTI-NdfR-systeem (of HT-NdfR) wordt het dihydride-intermediair geprotoneerd bij pH 7,5 om 2,4-dinitrocyclohexanon te vormen, dat een hydrolase-gekatalyseerde splitsing ondergaat tot 4,6-dinitrohexanoaat. Omdat dit laatste uiteindelijk naar de TCA-cyclus kan worden gekanaliseerd, is de biologische afbraak van TNP zelfonderhoudend en kan het op locaties die met hoge TNP-concentraties zijn verontreinigd, selectieve voordelen opleveren voor de afbrekende micro-organismen.

Voor de biologische afbraak van het TNT-analoog tetryl is bekend dat hydrolyse daarvan TNP kan opleveren, dat volledig microbieel kan worden afgebroken (Lewis et al., 2004). Enzymatische N-denitratie van tetryl onder anaerobe omstandigheden is ook waargenomen met de vorming van N-methyl-2,4,6-trinitroaniline (Myers en Spinnato, 2007), een trinitroaromatische verbinding waarvoor biologische afbreekbaarheidsexperimenten moeten worden uitgevoerd.

In conclusie, geen enkele microbe voert genoeg reacties uit om voordeel te halen uit de biologische afbraak van TNT (Copley, 2009). Het ontstaan van een mineralisatietraject kan sneller gaan wanneer binnen één microbe meerdere opeenvolgende reacties worden aangetroffen. Hoewel een dioxygenase-gekatalyseerde eliminatie van nitriet is gerapporteerd als de initiële reactie voor 2,6-DNP (Ecker et al., 1992), is de elektrofiele aanval van 2,4-DNP tot nu toe niet beschreven vanwege het negatieve inductieve effect van de hydroxylgroep en specifieke sterische hinder. Daarom wordt gewoonlijk een initiële hydrogenering van het aromatische ringsysteem waargenomen voor 2,4-DNP en TNP, zodat hun biologische afbraak wordt gekatalyseerd door dezelfde enzymatische machinerie in één microbe. Voor TNT- en DNT-isomeren zijn daarentegen verschillende biologische afbraaktrajecten waargenomen. Zo worden 2,4-DNT en 2,6-DNT volledig afgebroken via een initiële dioxygenase-reactie (Johnson et al., 2002). Bijgevolg zijn syntrofische processen, bijvoorbeeld reductieve denitratie van TNT tot 2,4-DNT gevolgd door oxidatieve biotransformatie van 2,4-DNT, voorgesteld als een geschikte strategie om TNT te mineraliseren (Tront en Hughes, 2005). Bij de denitratie van TNT in zowel zuivere als gemengde culturen treden echter meerdere concurrerende routes op, die bijgevolg leiden tot doodlopende gedenitreerde metabolieten in plaats van DNT-isomeren. In deze context kan experimenteel bewijs van de productie van 2,4-DNT uit TNT-biodegradatie gekatalyseerd door giststammen (Ziganshin et al., 2010a,b) van primair belang zijn om een mineralisatie-gedreven proces van TNT te implementeren.