Guinguette Marais Poitevin

MODES

Il s’agit d’une étude transversale menée pour l’évaluation du statut de sécréteur et de non sécréteur de l’ABH dans la population de Karachi (Pakistan). Cent un étudiants adultes en bonne santé (76 hommes, 25 femmes) âgés de 15 à 40 ans ont été sélectionnés au hasard pour cette étude. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les individus. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université médicale Baqai, Karachi. Dix ml de salive ont été recueillis dans des récipients en plastique stérilisés jetables auprès de tous les individus. Cinq ml (2 ml dans un tube EDTA tandis que 3 ml dans un tube non anticoagulé) de sang ont été collectés de tous les individus de manière aseptique pour le groupage cellulaire et sérique.

Procédure de groupage sanguin ABO et Rh :

Préparation d’une suspension de globules rouges à 3% : Deux ml de sang recueillis dans un tube EDTA anticoagulé ont été centrifugés à faible vitesse (1500 rpm) pendant 3 minutes. Le plasma a été transféré dans un autre tube et utilisé pour le groupage sérique. Le tube contenant les cellules a été rempli de solution saline normale. Le tube a été bien mélangé et re-centrifugé à 1500 rpm pendant 3 minutes. La procédure de lavage a été répétée deux fois. Lors du dernier lavage, le tube a été centrifugé à haute vitesse (3000rpm) pendant 3 minutes et le surnageant a été jeté. Un surnageant transparent et l’apparition d’une ligne de traînée cellulaire indiquent un lavage correct des cellules.

I : Regroupement des cellules : Trois tubes à essai en verre propres ont été étiquetés comme tube A pour l’anti A, tube B pour l’anti B et tube D pour l’anti D. Une goutte d’antisérum a été ajoutée comme sérum anti A au tube A, sérum anti B au tube B et sérum anti D au tube D. Une goutte de suspension de globules rouges à 3% a été ajoutée au tube A, tube B et tube D. Tous les contenus ont été bien mélangés. Tous les tubes ont été centrifugés immédiatement en balançant à 3400 rpm pendant 15 secondes. Tous les tubes ont été retirés doucement et le tube a été examiné individuellement pour l’agglutination.

II : Regroupement du sérum : Le sérum a été séparé du tube non anticoagulé après centrifugation pendant 5 minutes à 3000rmp. Trois tubes à essai en verre propre ont été étiquetés comme tube « a » pour les cellules A, tube « b » pour les cellules B et « o » pour les cellules O. Deux gouttes de sérum individuel ont été ajoutées à chaque tube. Une goutte de suspension de globules rouges à 3% connue de cellules A, B et O a été ajoutée aux tubes « a », « b » et « o ». Tous les contenus des tubes ont été bien mélangés et immédiatement essorés pendant 15 secondes. Tous les tubes ont été retirés doucement et le tube a été examiné individuellement pour l’agglutination.

Tous les échantillons ont été testés dans les 6 heures, en utilisant une suspension de globules rouges fraîche du même individu. Collecte et traitement de la salive : Dix ml de salive ont été collectés auprès de tous les individus dans un récipient en plastique jetable stérilisé et transférés du récipient dans un tube en verre jetable stérilisé. Le tube contenant la salive a été centrifugé à 2000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant a été transféré dans un autre tube en verre. Le tube contenant le surnageant de salive a été placé dans un bain-marie à 56oC pendant 30 minutes pour inactiver l’amylase salivaire. Le tube d’échantillon a été refroidi et re-centrifugé pendant 10 minutes à 2000 rpm. Le surnageant a été transféré dans un autre tube à essai jetable et utilisé pour le test d’inhibition de l’hémagglutination ou de neutralisation.

Principe du test d’inhibition de l’hémagglutination : Les substances ABH présentes sous forme soluble dans les fluides (par exemple, la salive) neutralisent leurs anticorps correspondants. Les anticorps ne seront plus en mesure d’agglutiner les globules rouges possédant les mêmes antigènes.11,12

Procédure du test d’inhibition de l’hémagglutination :

Préparation des dilutions de doublement des antisérums de groupes sanguins : Dix tubes à essai ont été placés dans un rack étiqueté en fonction du titre c’est-à-dire 1:2 (tube1), 1:4 (tube 2), jusqu’à 1:1024 (tube10). Deux cents microlitres de solution saline ont été ajoutés à tous les tubes. Au tube 1, 200-µl d’antisérum ont été ajoutés et bien mélangés. Deux cents µl de dilutions du tube 1 ont été transférés dans le tube 2 et bien mélangés. La même procédure a été répétée du tube 2 au tube 10. Deux cents µl d’antisérum dilué ont été jetés du tube 10. Chaque tube contenait une quantité égale d’antisérum et de solution saline. Cette solution à double dilution a été utilisée dans le test d’inhibition de l’agglutination de l’ourlet.

Trois rangées de 10 tubes à essai ont été placées dans un rack et étiquetées comme ; I : Tubes à double dilution (D/D) II : Tubes de contrôle (tubes de titrage) III : Tubes à essai (tubes d’inhibition).

La double dilution des antisérums spécifiques de groupe a été préparée dans la rangée I. Chaque tube a été étiqueté en fonction du titre, c’est-à-dire 1:2 (tube1), 1:4 (tube2) jusqu’à 1:1024 (tube10). Cent µl d’antisérum spécifique du groupe sanguin de chaque dilution ont été transférés dans les tubes étiquetés de manière correspondante dans les rangées II et III, comme indiqué dans le tableau I. Cent µl de solution saline ont été ajoutés à chaque tube de la rangée II. Cent µl de salive ont été ajoutés à chaque tube de la rangée III. Tous les tubes des rangées II et III ont été bouchés et bien mélangés. Ces tubes ont été incubés à 37°C pendant 30 minutes dans un bain-marie avec agitation périodique. Après incubation, 100 µl de suspensions de globules rouges spécifiques de groupe à 3% ont été ajoutés à chaque tube des rangées II et III et ont été bien mélangés. Tous les tubes ont été incubés à 37°C pendant 30 minutes. Tous les tubes ont été observés pour l’agglutination macroscopiquement sous une bonne source de lumière.

Interprétation des résultats :

• Secteur positif :

L’agglutination macroscopique à un titre plus élevé (1:128) dans le contrôle (rangée II) et à un titre plus faible (1:16) dans le test (rangée III) a indiqué la présence de substances de groupe sanguin dans la salive testée.

• Statut du sécréteur négatif:

Aucune différence dans le titre à partir duquel une agglutination visible dans les deux rangs impliquait l’absence de substances spécifiques du groupe sanguin dans la salive pour neutraliser l’antisérum.13

Analyse statistique : Le progiciel statistique pour les sciences sociales (SPSS) version 17 a été utilisé pour l’analyse des données. Des statistiques descriptives ont été utilisées pour le calcul des fréquences et des pourcentages.