O número de microtubos ligados a um cinétocoleo é variável: em Saccharomyces cerevisiae apenas uma MT liga cada cinétocoleo, enquanto que nos mamíferos pode haver 15-35 MTs ligadas a cada cinétocoleo. Contudo, nem todas as MT do fuso se ligam a um cinétocoleiro. Existem MT que se estendem de um centrooma para o outro (e são responsáveis pelo comprimento do fuso) e algumas mais curtas são interdigitadas entre as MT longas. O Professor B. Nicklas (Duke University), mostrou que, se se decompuser a fixação do MT-kinetochore utilizando um raio laser, os cromatídeos já não se podem mover, levando a uma distribuição cromossómica anormal. Estas experiências também mostraram que os cinetos têm polaridade, e que a fixação de cinetos aos MTs que emanam de um ou outro centrossoma dependerá da sua orientação. Esta especificidade garante que apenas um cromatídeo se deslocará para cada lado do fuso, assegurando assim a distribuição correcta do material genético. Assim, uma das funções básicas do cinétocolete é a fixação do MT ao fuso, que é essencial para segregar correctamente os cromatídeos irmãos. Se a ancoragem estiver incorrecta, podem ocorrer erros, gerando aneuploidia, com consequências catastróficas para a célula. Para evitar que isto aconteça, existem mecanismos de detecção e correcção de erros (como o ponto de verificação da montagem do fuso), cujos componentes residem também nos cinematecas. O movimento de um cromatídeo em direcção ao centrossoma é produzido principalmente pela despolimerização do MT no local de ligação com o cinétocoleiro. Estes movimentos requerem também a geração de força, envolvendo motores moleculares igualmente localizados nos cinéto-coretos.
Fixação dos cromossomas ao MT no fuso mitóticoEdit
Captura de MTsEdit
Durante a fase de síntese (fase S) no ciclo celular, o centrossoma começa a duplicar. Logo no início da mitose, ambos os centríolos em cada centrossoma atingem o seu comprimento máximo, os centrosomas recrutam material adicional e a sua capacidade de nucleação para microtúbulos aumenta. À medida que a mitose progride, ambos os centriomas separam-se para estabelecer o fuso mitótico. Desta forma, o fuso numa célula mitótica tem dois pólos que emanam microtubulos. Os microtubos são filamentos proteicos longos com extremos assimétricos, uma extremidade “menos”(-) relativamente estável junto ao centrossoma, e uma extremidade “mais”(+) resistindo a fases alternadas de crescimento-encolhimento, explorando o centro da célula. Durante este processo de procura, um microtubo pode encontrar e capturar um cromossoma através do cinéto-centro. As microtubulas que encontram e fixam um cinétocole se estabilizam, enquanto que as microtubulas que permanecem livres são rapidamente despolimerizadas. Uma vez que os cromossomas têm dois cinetos associados back-to-back (um em cada cromatídeo irmão), quando um deles se liga aos microtubos gerados por um dos pólos celulares, o cinetócoro no cromatídeo irmão fica exposto ao pólo oposto; por esta razão, na maioria das vezes o segundo cinétocole se apega aos microtubos que emanam do pólo oposto, de tal forma que os cromossomas são agora bi-orientados, uma configuração fundamental (também denominada anfítica) para assegurar a correcta segregação de ambos os cromatídeos quando a célula se dividirá.
Quando apenas um microtubo está ancorado a um kinetocore, inicia-se um movimento rápido do cromossoma associado em direcção ao pólo gerador desse microtubo. Este movimento é provavelmente mediado pela actividade motora em direcção ao “menos” (-) da proteína motora citoplasmática, que está muito concentrada nos cinétogramas não ancorados aos MTs. O movimento em direcção ao pólo é retardado até que os cinetos adquiram kMTs (MTs ancorados aos cinetos) e o movimento torna-se dirigido por alterações no comprimento dos kMTs. A cinética é libertada dos cinéto-cores à medida que estes adquirem kMTs e, em células cultivadas de mamíferos, é necessária para a inactivação do ponto de controlo do fuso, mas não para a congressão cromossómica no equador do fuso, aquisição de kMTs ou anáfase A durante a segregação cromossómica. Em plantas superiores ou em leveduras, não há evidência de tinina, mas outros cinesins para a (-) extremidade podem compensar a falta de tinina.
Outra proteína motora implicada na captura inicial de MT é CENP-E; esta é uma cinética de elevado peso molecular associada à corona fibrosa nos cinétocoros de mamíferos desde a prometafase até à anáfase. Nas células com baixos níveis de CENP-E, os cromossomas carecem desta proteína nos seus cinótopos, que muitas vezes são defeituosos na sua capacidade de congressgressismo na placa da metáfase. Neste caso, alguns cromossomas podem permanecer cronicamente mono orientados (ancorados a apenas um pólo), embora a maioria dos cromossomas possa congresar correctamente na placa da metafase.
É amplamente aceite que a fibra dos kMTs (o feixe de microtubos ligados ao cinétococole) é originada pela captura de MTs polimerizadas nos centros e pólos de fusos em células cultivadas de mamíferos. No entanto, as MTs directamente polimerizadas nos cinetos também podem contribuir significativamente. A forma como a região centrromérica ou cinéto-core inicia a formação de kMTs e a frequência com que isto acontece são questões importantes, porque este mecanismo pode contribuir não só para a formação inicial de kMTs, mas também para a forma como os cinéto-cores corrigem a ancoragem defeituosa das MTs e regulam o movimento ao longo dos kMTs.
Papel do complexo Ndc80Edit
MTs associados aos cine-tochores apresentam características especiais: em comparação com as MTs livres, os kMTs são muito mais resistentes à despolimerização induzida pelo frio, a pressões hidrostáticas elevadas ou à exposição ao cálcio. Além disso, os kMTs são reciclados muito mais lentamente do que as MTs astrais e as MTs de fuso com pontas livres (+), e se os kMTs forem libertados dos cinetos usando um feixe laser, despolimerizam-se rapidamente.
Quando ficou claro que nem a tinina nem o CENP-E são essenciais para a formação dos kMTs, outras moléculas devem ser responsáveis pela estabilização dos kMTs. O trabalho genético pioneiro em levedura revelou a relevância do complexo Ndc80 na ancoragem dos kMTs. Em Saccharomyces cerevisiae, o complexo Ndc80 tem quatro componentes: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p e Spc25p. Mutantes sem qualquer dos componentes deste complexo mostram a perda da ligação cine-microtubole, embora a estrutura do cinétocole não esteja completamente perdida. No entanto, os mutantes em que a estrutura do cinétocoro se perde (por exemplo mutantes Ndc10 em levedura) são deficientes tanto na ligação a microtubos como na capacidade de activar o ponto de verificação do fuso, provavelmente porque os cinétocos funcionam como uma plataforma na qual os componentes da resposta são montados.
O complexo Ndc80 é altamente conservado e foi identificado em S. pombe, C. elegans, Xenopus, galinha e humanos. Estudos sobre Hec1 (altamente expresso em células cancerosas 1), o homólogo humano do Ndc80p, mostram que é importante para a correcta congressão cromossómica e progressão mitótica, e que interage com componentes dos complexos de coesina e condensina.
Laboratórios diferentes mostraram que o complexo Ndc80 é essencial para a estabilização da ancoragem do cine-microtubulo, necessária para suportar a tensão centromérica implicada no estabelecimento da correcta congressão cromossómica em eucariotas altas. Células com função prejudicada de Ndc80 (usando RNAi, nocaute de gene, ou microinjecção de anticorpos) têm fusos anormalmente longos, falta de tensão entre cinétogramas irmãos, cromossomas incapazes de se congregar na placa da metafase e poucos ou quaisquer kMTs associados.
Existe uma variedade de forte suporte para a capacidade do complexo Ndc80 de se associar directamente com microtubos e formar o componente conservado do núcleo da interface cinéto-core-microtubular. No entanto, a formação de interacções robustas entre cinétocora e microtubos pode também requerer a função de proteínas adicionais. Em leveduras, esta ligação requer a presença do complexo Dam1-DASH-DDD. Alguns membros deste complexo ligam-se directamente a MTs, enquanto outros se ligam ao complexo Ndc80. Isto significa que o complexo Dam1-DASH-DDD pode ser um adaptador essencial entre cinétogramas e microtubos. Contudo, em animais não foi identificado um complexo equivalente, e esta questão permanece sob intensa investigação.
Verificação da ancoragem de cinéto-core-MTEdit
Durante S-Phase, a célula duplica toda a informação genética armazenada nos cromossomas, no processo denominado replicação de ADN. No final deste processo, cada cromossoma inclui dois cromossomas irmãos, que são duas moléculas de ADN completas e idênticas. Ambos os cromatídeos permanecem associados por complexos de coesina até à anáfase, quando ocorre a segregação dos cromossomas. Se a segregação cromossómica ocorrer correctamente, cada célula filha recebe um conjunto completo de cromatídeos, e para que isto aconteça cada cromatídeo irmão tem de ancorar (através do cinéto-core correspondente) a MTs geradas em pólos opostos do fuso mitótico. Esta configuração é denominada anfítica ou bi-orientação.
Contudo, durante o processo de ancoragem podem também aparecer algumas configurações incorrectas:
- monotelic: apenas um dos cromatídeos está ancorado a MTs, o segundo cinétocoleiro não está ancorado; nesta situação, não há tensão centrómica, e o ponto de verificação do fuso é activado, atrasando a entrada na anáfase e dando tempo à célula para corrigir o erro. Se não for corrigido, o cromatídeo não ancorado pode terminar aleatoriamente em qualquer das duas células filhas, gerando aneuploidia: uma célula filha teria cromossomas em excesso e a outra não teria alguns cromossomas.
- sintélico: ambos os cromatídeos estão ancorados a MTs que emanam do mesmo pólo; esta situação também não gera tensão centrromérica, e o ponto de controlo do fuso será activado. Se não for corrigida, ambos os cromatídeos terminarão na mesma célula filha, gerando aneuploidia.
- merotelic: pelo menos um cromatídeo é ancorado simultaneamente a MTs que emanam de ambos os pólos. Esta situação gera tensão centrromérica, e por esta razão o ponto de verificação do fuso não é activado. Se não for corrigido, o cromatídeo ligado aos dois pólos permanecerá como um cromossoma atrasado na anáfase, e finalmente será quebrado em dois fragmentos, distribuídos entre as células filhas, gerando aneuploidia.
Contexto monotérmico e sintáltico não geram tensão centrromérica e são detectados pelo ponto de controlo do fuso. Em contraste, a configuração merotelica não é detectada por este mecanismo de controlo. No entanto, a maioria destes erros são detectados e corrigidos antes da célula entrar na anáfase. Um factor chave na correcção destes erros de ancoragem é o complexo cromossómico de passageiros, que inclui a proteína cinase Aurora B, a sua subunidade alvo e activadora INCENP e duas outras subunidades, Survivin e Borealin/Dasra B (revista por Adams e colaboradores em 2001). As células em que a função deste complexo foi abolida por mutantes negativos dominantes, RNAi, microinjecção de anticorpos ou uso de drogas selectivas, acumulam erros na ancoragem cromossómica. Muitos estudos têm demonstrado que a Aurora B é necessária para desestabilizar a ancoragem incorrecta do cinéto-core-MT, favorecendo a geração de ligações anfíticas. Aurora B homologada em levedura (Ipl1p) fosforilatos algumas proteínas de cinéto-core, tais como a proteína constitutiva Ndc10p e membros dos complexos Ndc80 e Dam1-DASH-DDD. A fosforilação dos componentes do complexo Ndc80 produz a desestabilização da ancoragem dos kMTs. Foi proposto que a localização de Aurora B é importante para a sua função: como está localizada na região interior do cinéto-core (na heterocromatina centrómica), quando a tensão centrómica é estabelecida, os cinéto-cores irmãos separam-se, e Aurora B não consegue alcançar os seus substratos, de modo a que os kMTs sejam estabilizados. Aurora B é frequentemente sobreexpressa em vários tipos de cancro, e é actualmente um alvo para o desenvolvimento de medicamentos anticancerígenos.
Activação do ponto de controlo do fusoEdit
O ponto de controlo do fuso, ou SAC (para o ponto de controlo da montagem do fuso), também conhecido como ponto de controlo mitótico, é um mecanismo celular responsável pela detecção de:
- montagem correcta do fuso mitótico;
- ligação de todos os cromossomas ao fuso mitótico de uma forma bipolar;
- congressão de todos os cromossomas na placa metafásica.
Quando apenas um cromossoma (por qualquer razão) permanece atrasado durante a congressão, a maquinaria do fuso de controlo gera um atraso na progressão do ciclo celular: a célula é presa, dando tempo aos mecanismos de reparação para resolver o problema detectado. Após algum tempo, se o problema não tiver sido resolvido, a célula será alvo de apoptose (morte celular programada), um mecanismo de segurança para evitar a geração de aneuploidia, uma situação que geralmente tem consequências dramáticas para o organismo.
Quando proteínas centrómicas estruturais (tais como CENP-B), permanecem estáveis ao longo da mitose (incluindo durante a telófase), os componentes do fuso de controlo são montados no cinétocoleo em concentrações elevadas na ausência de microtubos, e as suas concentrações diminuem à medida que o número de microtubos ligados ao cinétoleo aumenta.
Na metáfase, os níveis CENP-E, Bub3 e Bub1 diminuem de 3 a 4 vezes em comparação com os níveis nos cinétogramas soltos, enquanto que os níveis de dynein/dynactin, Mad1, Mad2 e BubR1 diminuem >10-100 vezes. Assim, na metafase, quando todos os cromossomas estão alinhados na placa da metafase, todas as proteínas do ponto de controlo são libertadas do cinétocoleo. O desaparecimento das proteínas do ponto de controlo para fora dos cinetos indica o momento em que o cromossoma atingiu a placa da metafase e está sob tensão bipolar. Neste momento, as proteínas do ponto de controlo que se ligam e inibem o Cdc20 (Mad1-Mad2 e BubR1), libertam o Cdc20, que liga e activa o APC/CCdc20, e este complexo desencadeia a separação dos cromatídeos irmãos e consequentemente a entrada da anáfase.
Estudos transversais indicam que o complexo Ndc80 participa na regulação da associação estável de Mad1-Mad2 e dynein com cinétochores. No entanto, as proteínas associadas ao cinétocoro CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H e BubR1 são independentes do Ndc80/Hec1. A paragem prolongada em prometafase observada em células com baixos níveis de Ndc80/Hec1 depende de Mad2, embora estas células apresentem baixos níveis de Mad1, Mad2 e dynein em cinétochores (<10-15% em relação aos cinétochores não ligados). Contudo, se ambos os níveis de Ndc80/Hec1 e Nuf2 forem reduzidos, Mad1 e Mad2 desaparecem completamente dos cinetos e o ponto de controlo do fuso é inactivado.
Shugoshin (Sgo1, MEI-S332 em Drosophila melanogaster) são proteínas centrómeras essenciais para manter a coesina ligada a centrómeros até à anáfase. O homólogo humano, hsSgo1, associa-se com centrómeros durante a prófase e desaparece quando a anáfase começa. Quando os níveis de Shugoshin são reduzidos por RNAi nas células de HeLa, a cohesina não pode permanecer nos centrómeros durante a mitose, e consequentemente os cromatídeos irmãos separam-se sincronicamente antes do início da anáfase, o que desencadeia uma longa paragem mitótica.
Por outro lado, Dasso e colaboradores descobriram que as proteínas envolvidas no ciclo de Ran podem ser detectadas nos cinétogramas durante a mitose: RanGAP1 (uma proteína activadora de GTPase que estimula a conversão de Ran-GTP em Ran-GDP) e a proteína de ligação Ran chamada RanBP2/Nup358. Durante a interfase, estas proteínas estão localizadas nos poros nucleares e participam no transporte nucleo-citoplasmático. A localização cinetócica destas proteínas parece ser funcionalmente significativa, porque alguns tratamentos que aumentam os níveis de Ran-GTP inibem a libertação de cinetócitos de Bub1, Bub3, Mad2 e CENP-E.
Orc2 (uma proteína que pertence ao complexo de reconhecimento de origem -ORC- implicada no início da replicação de ADN durante a fase S) também é localizada nos cinetos durante a mitose em células humanas; de acordo com esta localização, alguns estudos indicam que o Orc2 em levedura está implicado na coesão dos cromatídeos irmãos, e quando é eliminado da célula, segue-se a activação do ponto de controlo do fuso. Alguns outros componentes do ORC (tais orc5 em S. pombe) foram também considerados como participando na coesão. Contudo, as proteínas de ORC parecem participar numa via molecular que é aditiva à via da coesina, e é na sua maioria desconhecida.
Geração de força para impulsionar o movimento cromossómicoEditar
Muitos movimentos cromossómicos em relação aos pólos do fuso estão associados ao alongamento e encurtamento dos kMTs. Uma das características mais interessantes dos cine-tochores é a sua capacidade de modificar o estado dos seus kMTs associados (cerca de 20) de um estado de despolimerização no seu (+) fim para o estado de polimerização. Isto permite que os cinéto-cores das células na fase prometa mostrem “instabilidade direccional”, mudando entre fases persistentes de movimento em direcção ao pólo (pólo para a frente) ou invertidas (anti-pólo para a frente), que estão ligadas a estados alternados de despolimerização e polimerização dos kMTs, respectivamente. Esta biestabilidade dos cinetos parece fazer parte de um mecanismo para alinhar os cromossomas no equador do fuso sem perder a ligação mecânica entre cinetos e pólos do fuso. Pensa-se que a biestabilidade do cinétocoleiro se baseia na instabilidade dinâmica da extremidade (+) dos kMTs, e é parcialmente controlada pela tensão presente no cinétoleiro. Nas células cultivadas de mamíferos, uma baixa tensão nos cinéto-cores promove a mudança no sentido da despolimerização dos kMTs, e uma alta tensão promove a mudança no sentido da polimerização dos kMTs.
Proteínas do cinéto-core e proteínas ligadas ao fim MTs (+) (colectivamente chamadas +TIPs) regulam o movimento do cinéto-core através da regulação da dinâmica do fim dos kMTs (+). Contudo, a interface cine-microtubular é altamente dinâmica, e algumas destas proteínas parecem ser componentes de boa-fé de ambas as estruturas. Dois grupos de proteínas parecem ser particularmente importantes: as kinesinas que funcionam como despolimerases, tais como as kinesinas KinI; e as proteínas ligadas aos fins MT (+), +TIPs, promovendo a polimerização, talvez antagonizando o efeito das despolimerases.
- KinI kinesins são chamadas “I” porque apresentam um domínio motor interno, que utiliza ATP para promover a despolimerização do polímero tubulínico, o microtubo. Nos vertebrados, o KinI kinesin mais importante que controla a dinâmica da montagem final (+) é o MCAK. No entanto, parece haver outros cinemas implicados.
- O primeiro inclui a proteína adenomatosa polipose coli (APC) e a proteína EB1 associada, que necessitam de MTs para se localizarem nos cinéto-cores. Ambas as proteínas são necessárias para uma correcta segregação dos cromossomas. A EB1 liga-se apenas a MTs em estado de polimerização, sugerindo que promove a estabilização dos kMTs durante esta fase.
li>Existem dois grupos de +TIPs com funções cinéto-core.
li> O segundo grupo de +TIPs inclui proteínas que podem localizar-se nos cinetos mesmo na ausência de MTs. Neste grupo existem duas proteínas que têm sido amplamente estudadas: CLIP-170 e as suas proteínas associadas CLASPs (proteínas associadas ao CLIP). O papel do CLIP-170 nos cinétochores é desconhecido, mas a expressão de um mutante negativo dominante produz um atraso na prometafase, sugerindo que tem um papel activo no alinhamento cromossómico. As proteínas CLASPs são necessárias para o alinhamento cromossómico e manutenção de um fuso bipolar em Drosophila, humanos e leveduras.