FilmEdit
Mastrantonio apareceu pela primeira vez no ecrã em Scarface (1983) de Brian De Palma como Gina, irmã de Tony Montana, de Al Pacino. Ela alcançou proeminência para o seu papel Oscar e Globo de Ouro – nomeado em The Color of Money (1986) em frente a Paul Newman e Tom Cruise.
Outros papéis destacados incluem Slam Dance (1987), em frente a Tom Hulce, e The January Man (1989) com Kevin Kline. Também estrelou a ficção científica do escritor/director James Cameron The Abyss (1989) com Ed Harris. Interpretou Maid Marian no filme Robin Hood: Prince of Thieves de 1991 ao lado de Kevin Costner. Interpretou a filha advogada da personagem de Gene Hackman em Acção de Classe, co-estrelou no thriller de 1992 Consenting Adults, e interpretou um capitão de barco de pesca em A Tempestade Perfeita (2000).
StageEdit
Mastrantonio tem aparecido na Broadway em vários musicais, incluindo West Side Story, Copperfield, The Human Comedy, e o renascimento do Homem de La Mancha em 2002, no qual interpretou Aldonza/Dulcinea em frente a Brian Stokes Mitchell. Actuou nas produções de Henry V, Measure for Measure, e Twelfth Night do Festival de Shakespeare de Nova Iorque. As suas actuações no palco da cidade de Nova Iorque valeram-lhe uma nomeação ao Tony Award e duas nomeações ao Drama Desk Award.
Ela também estrelou em Grand Hotel no Donmar Warehouse no West End de Londres. Em 1984, Mastrantonio foi apresentada numa actuação beneficente de A Christmas Carol com Helen Hayes, Raul Julia, Harold Scott, F. MacIntyre Dixon, e Len Cariou no Symphony Space em Nova Iorque. No palco, Mastrantonio estrelou mais recentemente em A View from the Bridge como Beatrice, ao lado de Ken Stott e Allan Corduner no Teatro Duque de York, Londres.
TelevisionEdit
Em 1991, Mastrantonio apareceu como Yelena numa produção do Tio Vanya na série Performance de antologia britânica.
A Mastrantonio teve um papel recorrente durante as Épocas 4-5 (2005-2007) do drama televisivo Without a Trace.
Mastrantonio interpretou a comandante de unidade Capitão Zoe Callas na Época 9 (2010) da Lei & Ordem: Criminal Intent.
Início com o episódio final da Temporada 1 (2012), Mastrantonio teve um papel recorrente em Grimm, interpretando Kelly Burkhardt, mãe da protagonista do espectáculo.
Em 2013, ela adivinhou Blue Bloods no episódio “Inside Jobs”. Ela teve um papel recorrente no programa Hostages 2013-14, interpretando a Primeira Dama Mary Kincaid.
Em 2015, ela foi elenco em papel de liderança na CBS, interpretando o Agente Especial do FBI em Charge Nasreen “Naz” Pouran, que estreou a 22 de Setembro de 2015.
Em 2017 ela foi convidada a estrelar como Marion James, Directora Adjunta da Agência Central de Inteligência, em três episódios de The Punisher on Netflix.
De 2018 a 2020, ela estrelou como Madeline Burke no drama de acção da NBC Blindspot.