METHODS
É um estudo transversal realizado para a avaliação do estatuto de secretários e não secretários da ABH na população de Karachi (paquistanesa). Cento e um estudantes adultos saudáveis (76 homens, 25 mulheres) entre os 15 e 40 anos de idade foram seleccionados aleatoriamente para este estudo. Foi obtido o consentimento informado por escrito de todos os indivíduos. Este estudo foi aprovado pelo comité de ética da Universidade de Medicina Baqai, Karachi. Dez ml de saliva foram recolhidos em recipientes plásticos descartáveis esterilizados de todos os indivíduos. Foram recolhidos cinco ml (2 ml em tubo EDTA enquanto 3 ml em tubo não anticoagulado) de sangue de todos os indivíduos em forma asséptica para agrupamento de células e soro.
procedimento de agrupamento de sangue ABO e Rh:
Preparação de 3% de suspensão de eritrócitos: Dois ml de sangue colhidos num tubo anti-coagulado EDTA foram centrifugados a baixa velocidade (1500 rpm) durante 3 minutos. O plasma foi transferido para outro tubo e utilizado no agrupamento do soro. O tubo contendo células foi enchido com soro fisiológico normal. O tubo foi bem misturado e centrifugado de novo a 1500 rpm durante 3 minutos. O procedimento de lavagem foi repetido duas vezes. Durante a última lavagem, o tubo foi centrifugado a alta velocidade (3000 rpm) durante 3 minutos e o sobrenadante foi descartado. O sobrenadante transparente e o aspecto da linha de fuga das células indica uma lavagem celular adequada.
I: Agrupamento de células: Três tubos de ensaio de vidro limpo foram rotulados como tubo A para anti A, tubo B para anti B e tubo D para anti D. Uma gota de anti-soro foi adicionada como anti A ao tubo A, anti B sera ao tubo B e anti D sera ao tubo D. Uma gota de 3% de suspensão de eritrócitos foi adicionada ao tubo A, tubo B e tubo D. Todo o conteúdo foi bem misturado. Todos os tubos foram centrifugados imediatamente, equilibrando a 3400 rpm durante 15 segundos. Todos os tubos foram retirados suavemente e o tubo foi examinado individualmente para aglutinação.
II: Agrupamento de soros: O soro foi separado do tubo não anticoagulado após centrifugação durante 5 minutos a 3000 rpm. Três tubos de ensaio de vidro limpo foram rotulados como tubo “a” para células A, tubo “b” para células B e “o” para células O. Duas gotas de soro individual foram adicionadas a cada tubo. Uma gota de 3% de suspensão conhecida de células A, B e O foi adicionada aos tubos “a”, “b” e “o”. O conteúdo de todos os tubos foi bem misturado e rodou imediatamente durante 15 segundos. Todos os tubos foram retirados suavemente e o tubo foi examinado individualmente para a aglutinação.
Todas as amostras foram testadas dentro de 6 horas, utilizando a suspensão de eritrócitos frescos do mesmo indivíduo. Recolha e processamento da saliva: Dez ml de saliva foram recolhidos de todos os indivíduos num recipiente de plástico descartável esterilizado e transferidos do recipiente para um tubo de vidro descartável esterilizado. O tubo contendo saliva foi centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de vidro. O tubo contendo o sobrenadante da saliva foi colocado num banho de água a 56oC durante 30 minutos para inactivar a amilase salivar. O tubo de amostra foi arrefecido e centrifugado de novo durante 10 minutos a 2000 rpm. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de ensaio descartável e utilizado para o teste de inibição ou neutralização da hemaglutinação.
Princípio do teste de inibição da hemaglutinação: As substâncias ABH presentes na forma solúvel em fluidos (por exemplo, saliva) neutralizam os seus anticorpos correspondentes. Os anticorpos já não serão capazes de aglutinar eritrócitos que possuam os mesmos antigénios.11,12
Teste de inibição da hemaglutinação:
Preparação de anti-soros do grupo sanguíneo, duplicando as diluições: Dez tubos de ensaio foram colocados num suporte rotulado de acordo com o título i.e. 1:2 (tubo 1), 1:4 (tubo 2), até 1:1024 (tubo 10). Duzentos microlitros de soro fisiológico foram adicionados a todos os tubos. Ao tubo 1, foram adicionados 200-µl de anti-soro e misturados bem. Duzentos µl de diluições do tubo 1 foram transferidos para o tubo 2 e misturados poço. O mesmo procedimento foi repetido do tubo 2 para o tubo 10. Duzentos µl de anti-soros diluídos foram descartados do tubo 10. Cada tubo continha igual quantidade de antissoros e soro fisiológico. Esta solução de diluição dupla foi utilizada no teste de inibição da aglutinação da bainha.
Três filas de 10 tubos de ensaio foram colocadas numa prateleira e rotuladas como; I: Dupla diluição (D/D) tubos II: Tubos de controlo (tubos de titulação) III: Tubos de ensaio (tubos de inibição).
Doubling dilution of group specific antisera was prepared in row I. Cada tubo foi rotulado de acordo com o título i.e. 1:2 (tubo1), 1:4 (tubo2) até 1:1024 (tubo10). Cem µl de anti-soros específicos do grupo sanguíneo de cada diluição foram transferidos para os tubos rotulados correspondentemente nas linhas II e III, como se mostra na Tabela I. Cem µl de solução salina foram adicionados a cada tubo da linha II. Cem µl de saliva foram adicionados a cada tubo da fila III. Todos os tubos das filas II e III foram selados e misturados bem. Estes tubos foram incubados a 37°C durante 30 minutos num banho de água com agitação periódica. Após a incubação, 100 µl de 3% de suspensões de eritrócitos específicos do grupo foram adicionados a cada tubo das filas II e III e foram misturados bem. Todos os tubos foram incubados a 37°C durante 30 minutos. Todos os tubos foram observados para a aglutinação macroscópica sob boa fonte de luz.
Interpretação dos resultados:
- p>estado de secretor positivo:
Aglutinação macroscópica ao nível superior (1:128) no controlo (linha II) e ao nível inferior (1:16) no teste (linha III) indicou a presença de substâncias do grupo sanguíneo na saliva do teste.
- p>Sigilo negativo:/li>
Nenhuma diferença no título em que a aglutinação visível em ambas as linhas implicava a ausência de substâncias específicas do grupo sanguíneo na saliva para neutralizar o anti-soro.13
Análise estatística: O pacote estatístico para ciências sociais (SPSS) versão 17 foi utilizado para análise de dados. A estatística descritiva foi utilizada para o cálculo da frequência e das percentagens.