(Bio)degradação Caminhos de Explosivos Nitroaromáticos
TNT, que tem um positivo Θzz, sofre principalmente transformações (bio)nucleófilas e redutoras devido ao carácter electrofílico do núcleo aromático e do átomo N do grupo nitro (Stenuit e Agathos, 2010). O fraccionamento isotópico C, N, e H de compostos nitroaromáticos em materiais subsuperficiais confirmou que o TNT sofre principalmente transformações redutoras enquanto que a transformação do 2,4-DNT, que se caracteriza por uma maior densidade de electrões do que o TNT, se deve principalmente à oxigenação (Wijker et al., 2013).
Consequentemente, o TNT é facilmente reduzido a nitroso, hidroxilamino, e em última análise a derivados amino aromáticos através de três transferências sucessivas de um par de electrões (Stenuit e Agathos, 2010). A etapa inicial de nitredução de quatro electrões é catalisada pelas típicas transferências de nitrotóxicos NAD(P)H (tipo I) sensíveis ao oxigénio (Stenuit e Agathos, 2010) e pelas transferências de hidretos tipo I e tipo II da família de enzimas amarelas antigas (OYE) (van Dillewijn et al., 2008). Tem sido sugerido que outras enzimas podem ser ainda mais envolvidas na última etapa de nitrodução de dois electrões para formar o aminoareno (Riefler e Smets, 2002).
Além disso, a TNT não está sujeita ao ataque electrofílico convencional por oxygenases. Inversamente, a TNT é propensa ao ataque nucleófilo conduzido por superóxido, como foi observado com o sistema biomimético contendo nucleótidos de piridina reduzidos e piocianina, um metabolito redox-activo segregado por Pseudomonas aeruginosa (Stenuit et al., 2009, Stenuit et al., 2012). Além disso, os produtos aniónicos σ, também denominados complexos TNT Meisenheimer, são prontamente produzidos pela formação de ligações covalentes entre nucleófilos, tais como a forma carregada negativamente de átomo de hidrogénio, H- (ião hidreto), e o anel aromático de TNT. Até agora, várias enzimas de bactérias e plantas têm sido caracterizadas para catalisar a adição nucleófila de iões de hidreto ao anel aromático de TNT, incluindo as transferências de hidreto de NAD(P)H específicas do tipo II OYE dependentes de NAD(P)H (Figura 3(a)) (Beynon et al., 2009, Durchschein et al., 2013) e, em muito menor medida, as transferências específicas de actinomicetos actinomycetálicos dependentes de F420 (Heiss e Knackmuss, 2002). Após a transferência de iões de hidreto para o anel aromático de TNT, são produzidos complexos de hidreto e diidrido Meisenheimer de TNT (-TNT e -TNT, respectivamente) e podem produzir ainda mais nitritos e diversos metabolitos denitrados de TNT que se acumulam tipicamente no meio de reacção. Portanto, mesmo que o azoto do TNT possa ser ainda mais assimilado através da actividade da nitrite redutase e da via glutamina-sintetizante glutamato sintético (GS-GOGAT), tem sido comumente observado que os metabolitos denitrados de TNT não podem ser utilizados como fonte de carbono. O problema inerente do extenso desvio químico e metabólico impede o aparecimento de uma via única de biodegradação benéfica para o TNT. Por exemplo, os produtos de condensação dos metabolitos de TNT podem ser produzidos entre (i) isómeros nitroso- e hidroxilamino-dinitrotolueno para formar compostos de tetranitroazoxittolueno como 4,4′,6,6′-tetranitro-2,2′-azoxittolueno e (ii) isómeros de hidroxilamino-dinitrotolueno e complexos de Meisenheimer protonado de TNT para formar diarilaminas secundárias (van Dillewijn et al., 2008). Os metabolitos de TNT derivados da redução da fracção nitro-metilo também podem sofrer oxidação de fracção metilo ou a acetilação de fracções de amino metilo (Stenuit e Agathos, 2010). Estes diversos compostos são geralmente referidos como metabólitos sem saída porque se acumulam. Além disso, a formação de metabolitos suicidas devido aos efeitos tóxicos dos intermediários e produtos secundários que são gerados pela redução da fracção nitrométrica parece ser uma barreira importante para um metabolismo produtivo de TNT (Lenke et al., 2000).
Figure 3. Biodegradação de nitro explosivos catalisados por (a) alguns membros da família OYE (por exemplo PETN reductase), (b) as reduções dependentes de F420 do cluster npd, e (c) o sistema XplA-XplB.
No entanto, alguns autores relataram recentemente vias de biodegradação benéficas do TNT com (i) a produção do composto metabolizável 2,4-dinitrotolueno (2,4-DNT) a partir do complexo monohidrido Meisenheimer de TNT (Stenuit e Agathos, 2010, Ziganshin et al, 2010a,b) e (ii) a evidência utilizando sonda isotópica estável (SIP) de assimilação de 15 N e 13C de TNT em ADN bacteriano (Gallagher et al.., 2010).
Vantagem da capacidade catabólica das leveduras Yarrowia lipolytica e Geotrichum candidum e a acidificação do meio de cultura através da produção de ácidos orgânicos, Ziganshin et al. (2010a,b) relataram a transformação em condições ácidas (i.e, a um pH < 4,2) de C3–TNT a 2,4-DNT, um metabolito mineralizável denitrado por TNT (Johnson et al.., 2002), com libertação concomitante de nitrito.
Using DNA-SIP and T-RFLP, Gallagher et al. (2010) relataram a utilização de TNT como fontes de carbono e azoto em condições sulfogénicas por uma estirpe de Lysobacter taiwanensis inicialmente presente em sedimentos estuarinos anaeróbios ricos em matéria orgânica. No entanto, a incorporação de TNT na biomassa celular de Lysobacter como substrato primário ou co-substrato (cometabolismo) ainda não foi elucidada. Embora sejam necessárias experiências adicionais em culturas axénicas para decifrar as vias completas de biodegradação catalisadas por L. taiwanensis, a demonstração inequívoca da assimilação bacteriana anaeróbia tanto de N como de C a partir de TNT detém novas possibilidades remediadoras promissoras, tais como ensaios de bioaugmentação de ambientes contaminados por TNT anaeróbio.
Embora as vias de biodegradação da TNT relatadas na literatura sejam exclusivamente apoiadas pelo cometabolismo, foram relatadas bactérias específicas da ordem Actinomycetales para utilizar a TNP como única fonte de azoto, carbono, e energia sem redução da nitro-metabolismo (por exemplo, ácido picrâmico, um derivado monoamino do TNP) (Hofmann et al., 2004). A principal via catabólica do TNP é a transferência de hidretos enzimáticos para o núcleo aromático, seguida de sucessivas reacções de desnitração e funilagem de metabolitos clivados no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). O aglomerado de genes de degradação do TNP (aglomerado npd) foi caracterizado, com a identificação de diferentes indutores e o regulador transcripcional NpdR (Nga et al., 2004). As enzimas envolvidas nas vias catabólicas periféricas de TNP em Rhodococcus opacus HL PM-1 são a hidretotransferase II (HTII), codificada por npdI, e a hidretotransferase I (HTI), codificada por npdC, que produzem o complexo monohidrido Meisenheimer de TNP (-TNP) e o complexo diidrido Meisenheimer de TNP (-TNP) (Nga et al., 2004), respectivamente. A actividade de HTII e HTI depende de uma F420 reductase (NdfR) dependente de NADPH, codificada por npdG, que actua como um vaivém de electrões entre NADPH e F420. Como ilustrado na Figura 3(b), a transferência de hidreto de coenzima reduzida F420H2 para o anel aromático do TNP é catalisada por HTII/HTI (Nga et al., 2004). Em Nocardioides simplex FJ2-1A, as mesmas vias catabólicas periféricas do TNP ocorrem excepto que uma única hidretotransferase (HT) catalisa a produção de -TNP e -TNP (Hofmann et al., 2004). Subsequentemente, a tautomerase NpdH, codificada por npdH, catalisa um tautomerismo de -TNP de protões para produzir a forma nitro (R2C(- H)NO2) e a forma aci-nitro (R2C=N+(- O-)OH) em equilíbrio. Este último sofre uma reacção de desnitração enzimática catalisada por extractos livres de células de R. opacus HL PM-1 ou N. simplex FJ2-1A (contendo uma denitrase órfã) para formar o complexo monohidrido Meisenheimer de 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) (Hofmann et al., 2004). Após uma segunda hidrogenação pelo sistema HTI-NdfR (ou HT-NdfR), o intermediário dihidreto é protonado a pH 7,5 para formar 2,4-dinitro-ciclohexanona, que sofre uma clivagem hidrolaseatalítica a 4,6-dinitrohexanoato. Como esta última pode finalmente ser canalizada para o ciclo do TCA, a biodegradação do TNP é auto-sustentável e pode proporcionar, em locais contaminados por elevadas concentrações de TNP, vantagens selectivas aos microrganismos degradantes.
Para a biodegradação do TNT tetryl analógico, reconhece-se que a sua hidrólise pode produzir TNP, que pode sofrer uma biodegradação microbiana completa (Lewis et al., 2004). Também se observou N-denitração enzimática da tetria em condições anaeróbias com a formação de N-metil-2,4,6-trinitroanilina (Myers e Spinnato, 2007), um composto trinitroaromático para o qual é necessário realizar experiências de biodegradabilidade.
Em conclusão, nenhum micróbio por si só realiza reacções suficientes para obter um benefício da biodegradação do TNT (Copley, 2009). A emergência de uma via de mineralização pode ser mais rápida quando várias reacções consecutivas são encontradas dentro de um único micróbio. Embora tenha sido relatada uma eliminação dioxigenase-catalítica de nitritos como reacção inicial para 2,6-DNP (Ecker et al., 1992), o ataque electrofílico de 2,4-DNP não foi descrito até agora devido ao efeito indutivo negativo do grupo hidroxil e ao impedimento estérico específico. Portanto, a hidrogenação inicial do sistema de anéis aromáticos é normalmente observada para 2,4-DNP e TNP de modo a que a sua biodegradação seja catalisada pela mesma maquinaria enzimática num único micróbio. Pelo contrário, foram observadas vias de biodegradação diferentes para os isómeros TNT e DNT. De facto, 2,4-DNT e 2,6-DNT são completamente degradados através de uma reacção inicial à dioxigenase (Johnson et al., 2002). Consequentemente, processos sintróficos, por exemplo, a desnitração redutora de TNT para 2,4-DNT seguida de biotransformação oxidativa de 2,4-DNT, foram propostos como uma estratégia adequada para obter a mineralização de TNT (Tront e Hughes, 2005). No entanto, múltiplas vias competitivas ocorrem durante a desnitrificação da TNT tanto em culturas puras como mistas e, como consequência, conduzem a metabolitos desnitrados sem saída em vez de isómeros de DNT. Neste contexto, a evidência experimental da produção de 2,4-DNT a partir da biodegradação de TNT catalisada por estirpes de leveduras (Ziganshin et al., 2010a,b) pode ser de primordial importância para implementar um processo de mineralização de TNT.