Desenho de pesquisa e métodos
Tecnologia de monitor de glucose não invasiva
A tecnologia utilizada para o dispositivo de medição da glucose baseia-se no princípio de que o corpo humano emite naturalmente uma forte radiação electromagnética na região do comprimento de onda do micrómetro e na descoberta de que essa radiação contém informação espectral de analitos de tecidos. Embora esta tecnologia patenteada tenha aplicações para medir os níveis de várias substâncias no corpo humano, o plano inicial é utilizá-la num monitor BG devido à significativa necessidade não satisfeita de substituir os actuais métodos de medição.
O corpo humano emite uma forte radiação electromagnética. As leis da física declaram que todos os objectos emitem radiação IR e que a intensidade da radiação e as características espectrais do objecto são determinadas pela sua temperatura absoluta bem como pelas propriedades e estados do objecto.
A lei do plano (19) descreve uma relação entre a intensidade radiante, a distribuição espectral e a temperatura do corpo negro. O corpo humano é um excelente emissor de corpo negro de luz de meio-íris precisamente na região espectral correcta. A característica espectral da emissão térmica é influenciada pela composição do tecido do indivíduo e pelas concentrações de analitos. A lei de Kirchhoff confirma que para todo o corpo à mesma temperatura e para o mesmo comprimento de onda, a absorptividade é igual à emissividade monocromática.
Sensores para medições de analitos devem ter a sensibilidade e selectividade necessárias, esterilidade, e estabilidade a longo prazo. Os sensores espectroscópicos podem satisfazer todos estes requisitos. Entre as várias regiões espectrais, a espectroscopia de infravermelhos médios oferece maior sensibilidade e selectividade devido ao conteúdo de informação da região da impressão digital. A selectividade desta tecnologia baseia-se no mesmo princípio que a selectividade do método da espectroscopia de absorção para medições de analitos. A glucose tem características espectrais muito bem definidas na região de IR da impressão digital, tal como demonstrado (por exemplo, nos estudos de Heise et al. e Vonach et al. e nos nossos espectros de emissão térmica de plasma Fig. 2).
Num arranjo experimental simples, é possível demonstrar que a emissão de glucose pode ser detectada utilizando detectores de temperatura ambiente numa configuração baseada em filtros. Um espectrómetro especialmente concebido à base de filtros não dispersivos (Fig. 1) realizou medições de absorção e emissão. Um espectrómetro com filtro tem a vantagem da simplicidade, uma elevada relação sinal/ruído, elevado rendimento, e baixo custo. As rodas filtrantes giratórias com curvas de transmissão características, quando colocadas no caminho da luz, geram bandas de passagem variáveis com baixa resolução. Como filtro, utilizámos um filtro IR variável circular, segmento #3, feito pelo Laboratório de Revestimento Óptico, com uma banda de transmissão de 7,7 a 14,1 μm. A radiação IR foi recolhida por um guia de ondas IR feito a partir de um tubo, com uma superfície interior banhada a ouro, que direccionava a radiação IR para um filtro variável em muito estreita proximidade. Do outro lado do filtro, um detector de termopilhas (Perkin Elmer/Heineman modelo TPS 434) foi colocado no eixo óptico do guia de onda muito próximo da superfície do filtro. A combinação do diâmetro do guia de onda, buraco de abertura do detector, e a dimensão da sua área sensível, foi executada como uma fenda na espectrometria padrão com <0.2-μm resolução espectral. Foi encontrada informação útil de dados espectrais no intervalo de 9-13 μm, devido à combinação do efeito de borda nas extremidades do filtro e resolução devido à largura da fenda. Pelo menos seis espectros foram calculados como média, e o procedimento de Fourier de seis pontos de suavização foi utilizado para remover o ruído rápido do espectro. Tanto os espectros de transmissão como os de emissão (após correcção para a emissão térmica de fundo do instrumento) foram divididos por valores teóricos de intensidade de radiação de corpo negro, resultando em valores proporcionais à absortividade e à emissividade monocromática. As alterações medidas na emissividade monocromática estavam na gama de 10-4, ainda acima do limite de ruído do sistema. Como exemplo, a figura 2A mostra os espectros de emissão térmica IR (a 41°C) de glicose (curva superior) num comprimido de KBr (brometo de potássio) com um espectro de transmitância (curva inferior) para comparação. Mesmo com estes espectros de má qualidade, pode-se observar bandas correspondentes de absorção de glucose, por exemplo, uma banda principal a 9,6 μm, uma banda a 10,9 μm (correspondente ao estado vibracional de 914 cm-1 de glucose), e uma banda mais fraca a cerca de 12 μm. Pode-se notar uma imagem típica de espelho entre os espectros de transmissão e de emissão. O espectro IR de glucose pura aponta bandas espectrais de assinatura de glucose fundamentais.
As características de emissão IR térmica de diferentes concentrações de glucose na água e nas soluções de plasma humano foram medidas. Segundo o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que tais medições foram relatadas. Os resultados das emissões de IR do plasma humano a 37°C são mostrados na Fig. 2B. Esta figura enfatiza duas características importantes: primeiro, mostra a região espectral de interesse e, segundo, apresenta uma prova experimental da capacidade de detecção de emissão térmica dos detectores de IV à temperatura ambiente actual. A deconvolução mostra bandas sensíveis e não sensíveis a alterações da concentração de glucose no plasma humano. Para maior clareza de visualização, os espectros são deslocados para cima ao longo do eixo vertical. Os resultados da deconvolução na tabela inserida mostram alterações de intensidade de pico versus concentração de glucose. Novamente, pode-se observar na emissão as bandas correspondentes de absorção de glucose, por exemplo, uma banda principal a 9,8 μm, uma banda a 10,9 μm (correspondente ao estado vibracional de 914 cm-1 de glucose), e uma banda mais fraca a cerca de 11,9 μm.
A radiação térmica do corpo humano contém informação sobre as características espectrais do objecto e é determinada pela temperatura corporal absoluta, bem como pelas propriedades e estados dos tecidos do corpo emissor. Assim, pode-se concluir que as características espectrais do sangue com diferentes conteúdos de glucose (ou outros analitos) alterarão a emissividade da membrana timpânica e tornarão possível medir a concentração de glucose no sangue.
A membrana timpânica é conhecida por estar numa posição excelente para medir a temperatura corporal porque partilha o seu fornecimento de sangue com o hipotálamo, o centro da regulação da temperatura corporal central. Um termómetro do tímpano mede a intensidade integral (sobre todos os comprimentos de onda) da radiação térmica IV. Um sensor inserido no canal auditivo pode obter uma visão clara da membrana e dos seus vasos sanguíneos para medir a quantidade de radiação infravermelha que a membrana emite. Quando comparada com a radiação teórica de corpo negro descrita pelas leis de Planck e Kirchhoff, esta radiação IV é espectralmente modificada pela composição do tecido. Assim, a radiação IV tem características espectrais de, por exemplo, sangue na membrana timpânica.
Neste instrumento, as características espectrais de vários constituintes do sangue foram separadas utilizando métodos de espectroscopia química analítica. O instrumento baseia-se na utilização de filtros IR colocados em frente das janelas do detector de IR. Um filtro passa radiação através das bandas de emissão térmica com assinaturas de glucose e é colocado numa das janelas do detector de IV, enquanto a outra janela do detector de IV é coberta por um filtro capaz de passar radiação que não inclui bandas de emissão características da substância a analisar nos comprimentos de onda na gama de interesse. Uma comparação da intensidade de radiação entre as duas janelas de detecção (como mostrado na Fig. 3) fornece uma medida que é proporcional à concentração da substância a analisar e pode ser correlacionada com a concentração de BG.
Figure 3 mostra um diagrama simplificado do instrumento. O instrumento recebe opticamente radiação IR do objecto alvo, como por exemplo uma membrana timpânica. O sistema de detecção consiste num conjunto de filtros IR ópticos e num detector de termopilha sensível na região IR da radiação do corpo humano. Um dos elementos de detecção é coberto por um filtro IR sensível à assinatura de glucose IR, enquanto um filtro apropriado que não tem bandas espectrais características do analito medido cobre a outra área de detecção. No nosso desenho do protótipo, foi utilizado um ponto chamado quase-isosbético em cerca de 8,5 μm para medições de referência de intensidade de emissão e 9,6 μm para medições de assinatura de glucose. A radiação IV espectralmente modificada da membrana do tímpano ilumina ambas as janelas. A diferença da intensidade de radiação entre as duas vias de radiação fornece uma medida proporcional à concentração do analito.
Designs de estudo clínico
O Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Connecticut aprovou o estudo, e todos os sujeitos deram o seu consentimento informado por escrito antes de participarem. Um total de 5 mulheres e 26 homens com diabetes insulino-requirente, com idades entre os 18 e os 75 anos, foram inscritos. Dois sujeitos inscritos foram excluídos dos testes. Um tinha fraco acesso venoso e o outro tinha uma concentração sérica de glucose >400 mg/dl no início do estudo e necessitava de tratamento médico. Foram utilizadas medições de glicose pareadas dos primeiros 23 indivíduos para calibrar a medição não invasiva da concentração de glicose na membrana timpânica com a concentração sérica de glicose de uma veia antecubital. Esta calibração foi subsequentemente testada comparando as concentrações de glucose da membrana timpânica com as concentrações de glucose no soro em seis sujeitos.
Na manhã do estudo, os sujeitos continuaram os seus medicamentos habituais mas não tomaram insulina nem tomaram o pequeno-almoço. O canal auditivo de cada sujeito foi examinado para verificar se a membrana do tímpano estava livre de cerúmen. Em quatro sujeitos, foi utilizada água quente para remover o cerúmen ocluindo a membrana do tímpano. Uma linha intravenosa foi colocada numa veia antecubital e mantida aberta com 0,45% de soro fisiológico. A 0 min e a cada 10 min, durante um total de 210-250 min, foi retirado 3 ml de sangue para medição da concentração sérica de glucose. Foi feita uma medição da concentração de glicose na membrana timpânica imediatamente após a realização da flebotomia. A insulina de acção prolongada habitual do sujeito foi administrada aos 0 min, um pequeno-almoço dietético consistente em hidratos de carbono foi administrado aos 30 min, e o bolo de insulina habitual do doente foi administrado aos 90 min. Para os sujeitos que não utilizavam normalmente um bolo de insulina, o bolo foi determinado pelo médico supervisor numa tentativa de normalizar a concentração sérica de glucose até ao final do estudo. O médico supervisor estava ciente dos resultados das medições da glucose sérica e fez intervenções clinicamente apropriadas para as concentrações de glucose sérica >400 mg/dl ou <60 mg/dl. A temperatura ambiente foi mantida entre 18 e 25°C. A temperatura oral, temperatura ambiente, e humidade ambiente do sujeito foram registadas a 0 min e a cada 30 min até ao fim do estudo. O intervalo de humidade relativa ambiente durante as experiências situou-se entre 20 e 60%. As medições da temperatura do ouvido IV foram feitas 2 min após cada medição de glicose. A enfermeira que efectuava as medições era cega às concentrações séricas de glucose da membrana timpânica.
Um total de 432 pontos de dados emparelhados de 20 sujeitos foram utilizados para a calibração da concentração de glucose da membrana timpânica com a concentração sérica de glucose. Uma enfermeira treinada fez as medições da concentração de glucose da membrana timpânica para 19 destes sujeitos. Quatro sujeitos foram treinados e efectuaram as medições da concentração de glicose na membrana timpânica sobre si próprios. Dois monitores estavam disponíveis para utilização. No modo de calibração, o monitor primário foi utilizado para 16 sujeitos. O monitor de reserva foi utilizado para quatro sujeitos.
Os resultados de três sujeitos não foram incluídos na análise de calibração. Os resultados de um sujeito que realizou as suas próprias medições e de dois outros sujeitos (com medições realizadas por uma enfermeira) foram rejeitados porque as leituras não cumpriam os critérios estabelecidos para a aceitabilidade de dados não invasivos dos instrumentos (ver métodos de análise de dados). O monitor principal foi utilizado para estes três sujeitos. Após a calibração do dispositivo não invasivo, o protocolo de estudo foi realizado de forma prospectiva e cega em seis sujeitos, todos utilizando o monitor primário. O observador que relatou a concentração de glucose na membrana timpânica e o observador que recebeu o relatório da concentração de glucose no soro foram cegos aos resultados da medição complementar. Todos os pontos de dados comunicados foram incluídos na análise de dados dos seis sujeitos estudados prospectivamente.
Métodos de análise de dados
Os estudos do monitor de glucose não-invasivo foram divididos em duas partes. Na primeira parte, o monitor foi calibrado utilizando um modelo de regressão não linear com dados do primeiro grupo de sujeitos. Na segunda parte, os estudos prospectivos foram realizados para validação da calibração e do método utilizado.
Na primeira parte da experiência, o observador que relatou a concentração de glucose na membrana timpânica teve acesso tanto às medições invasivas como não invasivas. Foram recolhidos dados de 23 sujeitos (511 pontos de dados emparelhados) para fins de calibração do monitor. Durante a análise dos dados de calibração, verificou-se que para três sujeitos, >50% das medições (22-25 medições foram realizadas num único sujeito) tiveram um erro no instrumento quando comparado com nenhum ou menos do que alguns erros para outros sujeitos. O erro do instrumento foi indicado se um sinal do detector do monitor não foi liso (o valor interno de um sinal do detector muda >20% para alguns dos 60 pontos de dados medidos subsequentes por inserção única do monitor no canal auditivo do sujeito) ou o sinal do detector estava fora do intervalo definido na dependência da temperatura ambiente e da humidade ambiente. O conjunto de erros para estes três sujeitos sugeriu um erro fundamental devido a interferência espectral médica (por exemplo, interferência espectral potencial de outros analitos que exigirá estudos especialmente concebidos ou um canal auditivo não recto ou bem distendido) ou procedimento de medição (o canal auditivo não foi devidamente selado pela ponta de medição do instrumento, a ponta de medição não foi colocada ao longo do canal auditivo e do eixo da membrana timpânica, ou ocorreu um erro técnico do operador no manuseamento das medições). Estes três sujeitos foram eliminados como entrada de dados para calibração. Para a calibração final, foram utilizados 20 sujeitos (um total de 432 pontos de dados emparelhados sem erros do instrumento), sendo o erro do instrumento indicado para 13 pontos de dados (2,9% de 445 pontos totais). Com base nos resultados da calibração, a análise de potência dos dados acima foi realizada por um estatístico da Universidade de Connecticut Health Center, que indicou que são necessários quatro a seis sujeitos para produzir um modo preditivo de medições para validação da calibração para o monitor de glucose não invasivo.
Na segunda parte da experiência, foram realizadas medições totalmente preditivas. O observador que relatou a concentração de glucose na membrana timpânica estava cego aos resultados das concentrações de glucose no soro de laboratório. As estimativas, tanto por métodos invasivos como não invasivos, foram feitas independentemente. Para os seis sujeitos, o instrumento indicou quatro erros de medição (3,1% de um total de 130 pontos de dados emparelhados). Uma vez feita e comunicada uma estimativa, nenhum ponto foi descartado. Esta segunda parte visava demonstrar a reprodutibilidade da metodologia uma vez estabelecida a calibração do monitor de glicose.
Uma análise estatística final dos resultados dos estudos não invasivos do monitor de BG foi feita utilizando um método de erro nas variáveis (também chamado “regressão ortogonal”). A regressão ordinária de mínimos quadrados assume que apenas as medições de coordenadas y estão associadas a erros de medição aleatórios. É frequentemente o caso que as incertezas nos dados se encontram tanto com as coordenadas x como y. Este é o caso em que tanto as quantidades x como y são observadas e, por conseguinte, sabe-se que existem erros. O modelo error-in-variables tem em conta os erros de medição de ambos os conjuntos de medições. Tais modelos incluem o Deming (20), o método de Passagem e Bablok (21), e a regressão ortogonal. O método Deming requer a especificação da relação entre os SD ao quadrado para duas grandezas observadas, mas não permite a utilização de diferentes SD na gama de grandezas x ou y medidas. A maioria dos procedimentos de regressão ortogonal distribui o erro igualmente nas coordenadas x e y. Nesta análise de estudos não invasivos de monitorização, foi utilizado o método de regressão ortogonal baseado num algoritmo descrito por Reilly et al. (22). O modelo acima permite introduzir erro de medição para ambos os eixos em toda a gama de grandezas medidas.
Medições de glucose sérica laboratorial
A concentração de glucose sérica laboratorial foi determinada pelo método da taxa de consumo de oxigénio utilizando um eléctrodo de oxigénio (Synchron LX20 Instrument; Beckman Instruments, Brea, CA). As medições laboratoriais SD fornecidas pelo Laboratório Clínico do Centro de Saúde da Universidade de Connecticut são as seguintes: para o nível de controlo de qualidade 1 (QC1) com um BG médio de 61 mg/dl, SD = ±2 mg/dl; para QC2 com um BG médio de 120 mg/dl, SD = ±4 mg/dl; e para QC3 com um BG médio de 373 mg/dl, SD = ±11 mg/dl. O erro relativo em toda a gama de concentrações de glucose foi de cerca de ±3,3%.