Construção do sistema
Após um alvo estrangeiro ter ultrapassado o limiar da tolerância imunitária, os componentes humoral e celular do sistema imunitário vertebrado são chamados à acção. Uma função chave é a apresentação do antigénio, que fornece o mecanismo de reconhecimento e resposta. As células B secretam anticorpos, que se ligam e marcam um antigénio, enquanto que as células T desempenham a função de atacar as células alvo. Tanto as células T como as células B também têm papéis na formação de células de memória. Como se mostra na figura. 1, dividimos esta série de eventos em três etapas (reconhecimento e tolerância, resposta imune, e matança e memória) sob o controlo de quatro componentes funcionais de ADN, incluindo os duplexes de ADN AM (imitação de célula com antigénios (APC)), BM (imitação de célula B), PG (gerador de primer, que gera iniciadores para o anticorpo analógico) e a CT de ADN circular de cadeia única (modelo circular, que controla a sequência do anticorpo analógico), bem como duas enzimas (Phi29 DNA polimerase e enzima de restrição SspI) capazes de responder de forma autónoma e programável a uma peça de entrada de DNA de cadeia única (ssDNA) patogénico (P0) retirado do genoma bacteriano. Quando não existe P0, o sistema é mantido num estado estável e equilibrado através do bloqueio efectivo dos domínios funcionais em cada componente. No entanto, quando desafiados pelo P0, estes domínios funcionais são activados numa série de passos concebidos para imitar os três passos dados acima.
AIRS consiste em três passos: (1) reconhecimento e tolerância, (2) resposta imune e (3) matança e memória. Estas funções são bloqueadas na ausência de entrada de ssDNA patogénico (P0), mas uma vez que o P0 é introduzido no sistema AIRS, é impulsionado por uma série de ADN paraehold-mediated deslocamento de fios e reacções enzimáticas de ADN. As barras coloridas indicam fios de ADN com domínios diferentes. Todos os domínios x são complementares ao x*; P0 é a sequência patogénica que possui capacidade de infecção na forma de ssDNA. AM (antigen-presenting cell imicry), BM (B-cell imicry) e PG (primer generator, que gera primers para o anticorpo analógico) estão inicialmente presentes como componentes duplex, juntamente com CT (modelo circular, que controla a sequência do anticorpo analógico) e duas enzimas funcionais, Phi29 polimerase e enzima de restrição SspI. TM (T Cell Mimicry); RCA (amplificação do ciclo de laminação). P1 e P2 são produtos de reacção de deslocamento.
No passo 1, na ausência de P0, os componentes funcionais do sistema permanecem em estase. Mimizando a tolerância imunológica, o estado não responsivo de defesa imunológica, a prioridade de reacção de P0 ao DNA duplex AM, bem como ao BM, é controlada através dos comprimentos dos seus correspondentes suportes, que são curtos segmentos salientes de ssDNA em duplex. Assim, concebemos um dez nucleótidos (nt) a deter em AM com uma taxa de reacção de deslocamento k de 106 M-1 s-1 e um 0 nt a deter em BM com um valor k de 103 M-1 s-1 para a hibridação inicial de P017,18. AM pode exibir P0, que tem dois domínios ssDNA, um com uma sequência retirada do genoma de Bacillus anthracis, uma bactéria Gram-positiva, em forma de bastão (P), e o outro concebido (domínio ssDNA 2-3-4) para controlar as reacções a jusante através de uma reacção de DNA-deslocamento. Contudo, na fase de reconhecimento e tolerância, o nosso sistema só pode proceder ao passo 2, resposta imunitária, quando a quantidade de patogéneo acumulado excede o limiar de AM.
Após o limiar de tolerância imunitária ser atingido no sistema, o passo 2, a resposta imunitária analógica humoral, é activada. Como anteriormente referido, durante o esgotamento de AM pela reacção de deslocamento, um dos produtos deslocados, ssDNA TM (mímica de célula T), acumula-se e pode ser utilizado como catalisador para aumentar a taxa de reacção entre P0 e BM, e assim libertar um primer (domínio 12a do ssDNA) para a amplificação do círculo rolante (RCA) de DNA polimerizado, que este sistema utilizará para produzir mímica de ‘anticorpos’ de DNA (P*) para o antígeno B. anthracis (P). Assim, para replicar a resposta imunitária de defesa do hospedeiro, incorporámos dois fragmentos de sequência genómica de B. anthracis (P) na TC, o que resultou numa geração rápida das sequências complementares P*, essencialmente por amplificação enzimática, usando a polimerase de ADN Phi29, a polimerase réplica da fago phi29 de B. subtilis, e o trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP), para imitar a geração rápida e específica de anticorpos naturalmente produzida pelas células B.
No passo 3, matança e memória, do sistema proposto foi necessário imitar o processo pelo qual a resposta imunitária mediada por células elimina os agentes patogénicos após a formação de um complexo anticorpo-antigénio do corpo, que, como acima referido, resulta da activação da resposta imunitária humoral pelos linfócitos B. Para o conseguir, foram assumidos três estados infecciosos: a vertente patogénica original P0 e os produtos da reacção de deslocamento (com AM e BM) P1 e P2. Em conjunto, todos estes contêm um domínio do agente patogénico infeccioso (P). Depois, para formar o complexo anticorpo-antigénio no sistema, o domínio P em P0, P1 e P2 hibridiza com uma grande quantidade de P* e forma regiões duplex estáveis PP*. Contudo, embora o sistema imunitário hospedeiro de vertebrados utilize a fagocitose como estratégia chave na remoção de agentes patogénicos, concebemos um método puramente biomecânico para imitar a activação da resposta imunitária humoral, ou seja a ligação entre o P* gerado e o domínio P do agente patogénico, seguido de uma etapa baseada em enzimas de restrição que imita a morte mediada por células, cortando especificamente o duplex ‘anti-corpo-antigénio’. Mais especificamente, esta última etapa é realizada quando a hibridação do domínio P com P* cria um local de reconhecimento activo da enzima de restrição SspI, que é extraída de uma estirpe de E. coli que transporta o gene sspi clonado e modificado (Y98F) do local de restrição da espécie Sphaerotilus. Desta forma, o domínio P em P0, P1 e P2 pode ser especificamente cortado em dois fragmentos com os números de nucleótidos 56 e 15 (ref. 19), perdendo assim a infecciosidade.
p>Next, no sistema imunitário adaptativo, algumas células T e B tornar-se-ão células de memória capazes de “lembrar” patogéneos específicos. Estas células de memória irão desencadear uma resposta imunitária muito mais rápida na exposição subsequente ao mesmo agente patogénico. Portanto, para criar um mecanismo para imitar a função de memória das células B, recorremos ao ssDNA TM, que é produzido pela reacção de deslocamento entre P0 e AM e permanece no sistema desde a primeira exposição a P0. Também descrevemos a sua catálise do deslocamento de P0 e BM para libertar rapidamente o primer, e assim desencadear uma reacção RCA mais rápida que cria anticorpos para a próxima exposição à mesma sequência patogénica. Esta reacção é definida como sendo induzida pela entropia porque é uma reacção que evolui espontaneamente para o equilíbrio termodinâmico (Suplemento Fig. 7)18. Sem MT, a taxa de deslocamento entre P0 e BM seria abrandada pelo bloqueio efectivo dos domínios activos em BM. No entanto, na presença de TM, BM pode hibridizar com TM através dos seus 4 nt de posse (domínio 5*) e depois libertar o iniciador ssDNA (PI) e o produto lateral W1, o que resulta numa nova região de posse de ligação (domínio 3*) para a hibridação entre P0 e BM, que é impulsionada termodinamicamente pelo ganho entropico das moléculas libertadas. Assim, o efeito da memória é produzido pela aceleração da taxa de reacção entre P0 e BM utilizando o efeito catalítico da restante TM produzida pelo reconhecimento inicial. Assim, ao deixar a TM como ‘combustível catalítico’ no sistema, obtém-se um efeito de memória para uma entrada de um patogéneo específico.
Verificação da transdução do sinal
Para assegurar o funcionamento correcto de toda a rede, a transdução do sinal em cada passo foi validada separadamente. Para examinar a precisão da função de limiar de AM, utilizámos um método baseado na transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) para estudar a ordem de hibridização de P0 com AM e BM. Um par de fluoróforos (fluoresceína (FAM)) e um supressor (DABCYL (DAB)) foi acoplado no duplex PG para indicar a quantidade libertada de primer para a reacção RCA. A restauração da fluorescência só ocorre se o nível limite de AM for excedido, após o que a reacção passa à etapa 2, resposta imune, com base em reacções de deslocamento de cordão que podem libertar o cordão de primer rotulado de supressor. Portanto, na presença de 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM fluoróforo/quencher PG rotulado, diferentes concentrações de P0 (de 0 a 150 nM) foram introduzidas no sistema com monitorização de fluorescência a 517 nm. Como mostrado na Fig. 2b, a restauração da fluorescência mostrou uma subida acentuada na concentração de P0 de 80 nM, mas pouco aumento abaixo de 80 nM, o que indica que a reacção entre P0 e BM tinha começado no ponto de esgotamento de AM. Por outras palavras, o valor limiar de AM a P0 é ajustável através da alteração da concentração de AM. Neste caso, o ponto de esgotamento, ou nível de limiar de AM foi atingido a 80 nM, o que indica que a reacção entre P0 e BM poderia iniciar a etapa 2, que, nos humanos, é a produção de anticorpos por linfócitos B. Para confirmar ainda mais este resultado, foi monitorizada a cinética de fluorescência do sistema acima referido. Inicialmente, 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM PG foram misturados no tampão, e uma pequena quantidade de P0 (30 nM) foi adicionada. Como resultado do excesso de AM e da sua prioridade de reacção ao P0 pelos requisitos da etapa 1, ocorreu uma lenta cinética de restauração da fluorescência. No entanto, quando mais P0 (30 nM de cada vez) foi adicionado continuamente ao sistema, verificou-se um aumento acentuado (após 90 nM no total) na cinética de fluorescência, o que indica que a reacção poderia prosseguir para o passo 2. Foram testados diferentes valores limiares através da alteração das concentrações de AM e BM (Figura Suplementar 1). A electroforese em gel foi também utilizada para indicar a ordem das reacções (Suplemento Fig. 2). Como o mesmo domínio de reconhecimento (2-3-4) é partilhado, resultados experimentais semelhantes foram também observados através da substituição de P0 por outra sequência patogénica, P0-SARS (ADN genómico do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave) (Suplemento Fig. 3). Todos os ensaios confirmaram a função de limiar eficaz do AM em relação à reacção entre o BM e o P0, e assim forneceram uma imitação macroscópica do estado de “reconhecimento e tolerância” do AIS.
a, Esquema dos passos de reacção que ocorrem nos passos 1 e 2. W2 é o produto lateral da reacção de deslocamento de PI e PG. b, Lote de restauração da fluorescência do sistema com 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB-labelled PG com diferentes concentrações do patogénico ssDNA P0. c, Experiências cinéticas do sistema com 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB-labelled PG. Em cada momento, 30 nM P0 foram adicionados ao tampão separadamente. d, Experiências cinéticas para estudar o efeito catalítico da TM. A curva negra representa a cinética de fundo com 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-labelled PG e sem P0. A curva vermelha mostra a cinética de reacção não catalisada com 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB rotulado PG e 150 nM P0. A curva azul mostra a cinética de reacção catalítica com 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB rotulado PG e 150 nM P0. As experiências foram realizadas a 25 °C em tampão Tris-HCl 50 mM que continha 10 mM MgCl2. a.u., unidades arbitrárias.
Outra função significativa do AM é produzir ssDNA TM catalítico para facilitar a reacção de hibridação entre P0 e BM, o que, de acordo com Zhang et al.18, pode acelerar a reacção de hibridação em duas a quatro ordens de magnitude. ssDNA TM não só é importante para facilitar a hibridação entre P0 e BM, mas também é fundamental para a formação de ‘células de memória miméticas’. Portanto, para provar o efeito catalítico da TM, continuámos a utilizar o nosso modelo de relatório baseado na FRET, tal como descrito acima. Assim, 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB foram incubadas em tampão. Posteriormente, 150 nM P0 foram adicionados ao sistema. Foi utilizada uma quantidade excessiva de P0 a AM para ultrapassar o valor limiar. TM é gerado no passo 1 como resultado da reacção entre P0 e AM. Assim, P0, quando ultrapassa o limiar (tal como estabelecido através do controlo da concentração de AM), por sua vez, resulta numa reacção catalítica entre o excesso de P0 e TM por entropia que pode rapidamente restaurar a fluorescência do sistema. Como comparação, a mesma concentração de P0 foi adicionada directamente a uma solução com 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB rotulada PG, mas sem AM. Como demonstrado na Fig. 2d, as medições da cinética de fluorescência da reacção catalisada apresentaram uma aceleração superior a 500 vezes, em contraste com a sem catálise18,20. Assim, como explicado acima, a MT libertada poderia servir como mímica de memória específica, o que resulta numa resposta imune mais forte e mais rápida para a próxima exposição ao mesmo agente patogénico. Posteriormente, confirmamos também que a quantidade de P* gerada a partir da amplificação enzimática para hibridação com domínio P em P0, P1 e P2 poderia ser determinada pela quantidade de primário, tornando assim a reacção enzimática controlável pelas reacções a montante nos passos 1 e 2 (ver as Informações Suplementares). Além disso, a digestão baseada em restrição enzimática do complexo antigénio-anticorpo gerado foi estudada e é mostrada na Informação Suplementar.
Desempenho de todo o sistema
Após confirmarmos a função adequada de cada etapa, testamos ainda mais o desempenho de todo o sistema com a mesma entrada de filamentos patogénicos do genoma B. anthracis (P0). Para confirmar a tolerância do AIRS, uma pequena quantidade de P0 (100 nM) foi então adicionada ao sistema, e a fluorescência foi monitorizada em tempo real. Em seguida, concebemos um farol molecular de ADN (MB-R) para reportar a quantidade de produto RCA fluorescentemente, utilizando o genoma patogénico B. anthracis sequência genómica P como o seu laço. MB-R poderia ser aberto pelos produtos RCA, ou seja, P*, e assim exibir uma restauração de fluorescência que representa diferentes quantidades de P*. A figura 3a mostra que a cinética de fluorescência é semelhante à sem P0, o que confirma que o sistema não é activado para produzir P* quando a quantidade de patogéneo está abaixo do nível de tolerância imunológica (ou seja, um limiar de 200 nM). Contudo, quando mais 150 nM P0 foram adicionados ao sistema para imitar uma segunda exposição ao mesmo agente patogénico, a restauração da fluorescência mostrou um comportamento cinético muito mais rápido, o que indica a produção de uma grande quantidade de P* e um desencadeamento bem sucedido da resposta imunitária. Além disso, a resposta mais rápida durante a segunda exposição também confirma o efeito de memória deste sistema para um agente patogénico específico. Se o P0-SARS for utilizado como entrada de um agente patogénico e um farol molecular codificado com P0-SARS (MB-R-SARS) for utilizado como repórter, são observadas tendências semelhantes de fluorescência-resposta, como mostra a Fig. 3b, que indica que o AIRS funciona potencialmente para uma segunda entrada de agente patogénico. Também utilizámos um sistema diferente de relatório de fluorescência para indicar a quantidade de P* gerada, que é mostrada na Fig. 10.
a,b, A cinética de fluorescência da geração de imitação de anticorpos P*(P*-SARS) foi monitorizada com diferentes concentrações de P0 (a) e P0-SARS (b). Aqui utilizámos o dobro das quantidades dos componentes individuais de ADN em comparação com os utilizados para os dados mostrados na Fig. 2 para assegurar que as concentrações eram consistentes com a experiência do gel.
Utilizando um relator de fluorescência em experiências independentes, foi demonstrado que a AIRS funciona igualmente bem com duas entradas diferentes de agentes patogénicos. Por conseguinte, estudou-se em seguida se poderia também funcionar quando duas entradas diferentes foram apresentadas simultaneamente. Para fazer esta determinação, P0 e P0-SARS foram introduzidos juntos numa solução que continha todos os componentes (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0.5 U μl-1 Phi29 e 250 μM dNTP). Como na experiência acima referida, foram também acrescentadas duas balizas moleculares diferentes com o mesmo fluoróforo e supressor (MB-R e MB-R-SARS) à mistura para reportar as quantidades de ambos os produtos RCA fluorescentes, ou seja, P* e P*-SARS. Como mostrado na Fig. 14 suplementar, enquanto ambas as entradas de agentes patogénicos estiverem abaixo do nível de tolerância imunológica (limiar de 300 nM), o AIRS não é activado e a fluorescência permanece inalterada em comparação com o sinal de fundo. No entanto, quando as concentrações aumentam para um nível superior ao limiar de um, ou de ambos, agentes patogénicos, a fluorescência é restaurada, o que indica que ambas as entradas de agentes patogénicos podem gerar uma imitação de anticorpos correspondente quando misturados. Isto confirma que a AIRS tem a capacidade de responder simultaneamente a duas entradas diferentes de agentes patogénicos.
Para caracterizar ainda mais o funcionamento livre de erros do sistema AIRS, utilizámos a electroforese em gel para analisar a quantidade final de P*. Como mostrado na Fig. 4a, apenas uma faixa afiada de elevado peso molecular pode ser vista quando a quantidade de patogéneo excede o nível limite (100 + 150 nM), o que é consistente com os resultados anteriores da fluorescência. Para estudar a ligação entre a vertente de entrada do agente patogénico (P0) e a vertente de imitação de anticorpos (P*) no passo 3, modificámos P0 com um fluoróforo (FAM). Após a geração de P*, foi confirmada a hibridação entre P0 e P*, uma vez que uma faixa de elevado peso molecular podia ser vista no canal de imagem do isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Suplemento Fig. 13). Com a adição de mais P0 (de um a 250 em excesso) ao sistema, foi ainda observada a hibridação entre o excesso de P0 e o P* gerado, o que indica que a AIRS podia ligar suficientemente o fio de entrada do patogéneo em excesso (P0) pela RCA. Finalmente, incubámos a enzima de restrição (2 U µl-1) juntamente com todos os outros componentes (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 e 250 µM dNTP). Após a introdução de uma concentração excessiva de FAM marcada P0 (500 nM) para superar a tolerância imunológica do sistema, foi descoberta uma banda de fragmentos de digestão com uma modificação FAM (56 nt) sob o canal FITC, o que leva a concluir que o patogéneo tinha sido digerido com sucesso (Fig. 4b). Curiosamente, se o P0 for substituído por uma entrada de polimorfismo de nucleótido duplo (P0-mis), ainda é possível gerar anticorpos que imitam P* com um excesso de concentração de P0-mis. Contudo, a hibridização entre P0-mis e P* não pode ser digerida pela enzima de restrição SspI, o que demonstra que o sistema AIRS é sensível ao reconhecimento do polimorfismo de nucleótidos da entrada do agente patogénico (Suplemento Fig. 11). O AIRS foi concebido com duas camadas de selectividade, o que permite ao sistema diferenciar o P0 de um input de polimorfismo de nucleótido duplo, P0-mis. Para explicar, a capacidade de ligação relativamente mais fraca entre P0-mis e P* quando comparada com a de P0 e P* torna o duplex P0-mis-P* menos estável. Além disso, um duplex de descoordenação P0-mis-P* não pode formar um local de ligação de reconhecimento eficaz com a enzima de restrição SspI (AAT-ATT), e assim reduzir a taxa de digestão da enzima, o que, por sua vez, resulta em muito menos produto de clivagem da entrada P0-mis (Fig. 11 suplementar). Em contraste, porque a hibridação de P0-SARS com P* cria um local de ligação de reconhecimento idêntico ao da enzima de restrição SspI, foram encontrados resultados semelhantes de electroforese em gel (Fig. 4c), o que mais uma vez confirma que o AIRS pode funcionar para diferentes entradas de agentes patogénicos.
a, Análise da geração de anticorpos imitadores P* por gel de agarose (1,5%). L, escada de 100 pares de bases. A imagem foi obtida sob um canal de imagem de brometo de etídeo (EB) (λexcitation = 520 nm, λemission = 605 nm). b, Validação do desempenho do sistema analógico AIRS com vertente patogénica P0 por gel de agarose (1%). M é a mistura dos componentes originais presentes no AIRS. Aqui M = mistura de 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 e 250 µM dNTP; tempo de incubação, uma hora. Pista 1, M + 0 nM FAM-labelled P0; pista 2, M + 100 nM FAM-labelled P0; pista 3, M + 500 nM FAM-labelled P0; pista 4, M + 100 nM FAM-labelled P0 + 2 U µl-1 SspI; pista 5, M + 500 nM FAM-labelled P0 + 2 U µl-1 SspI; L, escada de 1 kb. c, Validação do desempenho do sistema analógico AIRS com a vertente patogénica P0-SARS por gel de agarose (1%). M = mistura de 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0,5 U µl-1 Phi29 e 250 µM dNTP; tempo de incubação, uma hora. Pista 1, M + 0 nM FAM-labelled P0-SARS; pista 2, M + 100 nM FAM-labelled P0-SARS; pista 3, M + 500 nM FAM-labelled P0-SARS; pista 4, M + 100 nM FAM-labelled P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; pista 5, M + 500 nM FAM-labelled P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; L, escada de 1 kb.
Finalmente, como acima referido, a especificidade do sistema depende principalmente da enzima de restrição e da sequência da CT (ver a Informação Suplementar). Quando desafiámos o sistema introduzindo o P0-SARS marcado com FAM como a entrada patogénica, mas o CT para B. antracis como modelo de amplificação, não apareceu nenhuma banda fluorescente óbvia de elevado peso molecular com pequenas ou grandes quantidades de P0-SARS sob o canal FITC, devido à falta de hibridação entre P0-SARS e P* especificamente gerada para B. antracis (Suplemento Fig. 12).