Systemaufbau
Wenn ein fremdes Ziel die Schwelle der Immuntoleranz überschritten hat, werden die humoralen und zellulären Komponenten des Wirbeltier-Immunsystems zum Einsatz gebracht. Eine Schlüsselfunktion ist die Antigenpräsentation, die den Mechanismus für die Erkennung und Reaktion bereitstellt. B-Zellen sezernieren Antikörper, die an ein Antigen binden und es markieren, während T-Zellen die Aufgabe übernehmen, die Zielzellen anzugreifen. Sowohl T- als auch B-Zellen haben auch eine Rolle bei der Bildung von Gedächtniszellen. Wie in Abb. 1 gezeigt, haben wir diese Reihe von Ereignissen in drei Schritte unterteilt (Erkennung und Toleranz, Immunantwort sowie Abtötung und Gedächtnis), die von vier funktionellen DNA-Komponenten kontrolliert werden, darunter die DNA-Duplexe AM (Antigen-präsentierende Zelle (APC) Mimikry), BM (B-Zell Mimikry), PG (Primer-Generator, (Primergenerator, der Primer für den analogen Antikörper erzeugt) und einzelsträngige zirkuläre DNA CT (zirkuläres Template, das die Sequenz des analogen Antikörpers steuert) sowie zwei Enzyme (Phi29-DNA-Polymerase und SspI-Restriktionsenzym), die in der Lage sind, autonom und programmierbar auf ein ankommendes Stück einzelsträngiger DNA (ssDNA) als Erregerinput (P0) aus dem bakteriellen Genom zu reagieren. Wenn kein P0 vorhanden ist, wird das System durch die effektive Blockierung der funktionellen Domänen in jeder Komponente in einem stabilen, ausgeglichenen Zustand gehalten. Wird das System jedoch durch P0 herausgefordert, werden diese funktionellen Domänen in einer Reihe von Schritten aktiviert, die die drei oben genannten Schritte nachahmen.
AIRS besteht aus drei Schritten: (1) Erkennung und Toleranz, (2) Immunantwort und (3) Abtötung und Gedächtnis. Diese Funktionen sind in Abwesenheit von ssDNA-Pathogen-Input (P0) blockiert, aber sobald P0 in das AIRS-System eingeführt wird, wird es durch eine Reihe von DNA-Toehold-vermittelten Strangverschiebungen und DNA-Enzymreaktionen angetrieben. Farbige Balken zeigen DNA-Stränge mit unterschiedlichen Domänen an. Alle x-Domänen sind komplementär zu x*; P0 ist die Erregersequenz, die in der ssDNA-Form die Infektionsfähigkeit besitzt. AM (Antigen-präsentierende Zellmimikry), BM (B-Zell-Mimikry) und PG (Primer-Generator, der Primer für den analogen Antikörper generiert) liegen zunächst als Duplex-Komponenten vor, zusammen mit CT (zirkuläres Template, das die Sequenz des analogen Antikörpers steuert) und zwei funktionellen Enzymen, der Phi29-Polymerase und dem Restriktionsenzym SspI. TM (T Cell Mimicry); RCA (Rolling Cycle Amplification). P1 und P2 sind Produkte der Verdrängungsreaktion.
In Schritt 1, in Abwesenheit von P0, bleiben die funktionellen Komponenten des Systems in Stasis. In Anlehnung an die Immuntoleranz, dem unempfindlichen Zustand der Immunabwehr, wird die Reaktionspriorität von P0 auf die Duplex-DNA AM sowie auf BM durch die Länge ihrer entsprechenden Toeholds, das sind kurze ssDNA-Überhangsegmente in Duplexen, gesteuert. Dementsprechend haben wir für die initiale P0-Hybridisierung einen zehn Nukleotide (nt) langen Toehold in AM mit einer Verdrängungsreaktionsrate k von 106 M-1 s-1 und einen 0 nt langen Toehold in BM mit einem k-Wert von 103 M-1 s-1 entworfen17,18. AM kann P0 darstellen, das über zwei ssDNA-Domänen verfügt, von denen eine eine Sequenz aus dem Genom von Bacillus anthracis, einem Gram-positiven, stäbchenförmigen Bakterium, aufweist (P), und die andere (ssDNA-Domäne 2-3-4) zur Steuerung von Downstream-Reaktionen durch eine DNA-Verdrängungsreaktion konzipiert ist. In der Erkennungs- und Toleranzphase kann unser System jedoch nur dann zu Schritt 2, der Immunantwort, übergehen, wenn die Menge des akkumulierten Pathogens die Schwelle der AM überschreitet.
Wenn die Schwelle der Immuntoleranz im System erreicht ist, wird Schritt 2, die analoge humorale Immunantwort, aktiviert. Wie bereits erwähnt, sammelt sich während der Abreicherung von AM durch die Verdrängungsreaktion eines der verdrängten Produkte, die ssDNA TM (T-Zell-Mimikry), an und kann als Katalysator verwendet werden, um die Reaktionsrate zwischen P0 und BM zu erhöhen und so einen Primer (ssDNA-Domäne 12a) für die DNA-Polymerase-katalysierte Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) freizusetzen, die dieses System zur Herstellung von DNA-„Antikörper“-Mimikry (P*) gegen das Antigen B. anthracis (P) verwenden wird. Um die Immunantwort der Wirtsabwehr nachzubilden, bauten wir zwei genomische Sequenzfragmente von B. anthracis (P) in den CT ein, was zu einer schnellen Generierung der komplementären Sequenzen P* führte, im Wesentlichen durch enzymatische Amplifikation unter Verwendung der Phi29-DNA-Polymerase, der replikativen Polymerase aus dem B. subtilis-Phagen phi29, und Desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP), um die schnelle und antikörperspezifische Generierung zu imitieren, die natürlich von B-Zellen produziert wird.
In Schritt 3, Abtötung und Gedächtnis, des vorgeschlagenen Systems war es notwendig, den Prozess nachzuahmen, durch den die zellvermittelte Immunantwort Pathogene nach der Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes aus dem Körper eliminiert, was, wie oben erwähnt, aus der Aktivierung der humoralen Immunantwort durch B-Lymphozyten resultiert. Dazu wurden drei infektiöse Zustände angenommen: der ursprüngliche Erregerstrang P0 und die Produkte der Verdrängungsreaktion (mit AM und BM) P1 und P2. Diese enthalten alle zusammen eine infektiöse Erregerdomäne (P). Um den Antikörper-Antigen-Komplex im System zu bilden, hybridisiert dann die P-Domäne in P0, P1 und P2 mit einer großen Menge an P* und bildet stabile Duplex-Regionen PP*. Obwohl das Wirtsimmunsystem der Wirbeltiere die Phagozytose als Schlüsselstrategie zur Beseitigung von Pathogenen einsetzt, haben wir eine rein biomechanische Methode entwickelt, um die Aktivierung der humoralen Immunantwort zu imitieren, d. h. die Bindung zwischen dem erzeugten P* und der P-Domäne des Pathogens, gefolgt von einem Restriktionsenzym-basierten Schritt, der die zellvermittelte Abtötung durch spezifisches Schneiden des „Antikörper-Antigen“-Duplexes imitiert. Genauer gesagt wird dieser letzte Schritt erreicht, wenn die Hybridisierung der P-Domäne mit P* eine aktive Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym SspI schafft, das aus einem E. coli-Stamm extrahiert wird, der das klonierte und modifizierte (Y98F) sspi-Gen aus der Restriktionsstelle von Sphaerotilus species trägt. Auf diese Weise kann die P-Domäne in P0, P1 und P2 spezifisch in zwei Fragmente mit den Nukleotidnummern 56 und 15 geschnitten werden (Ref. 19), wodurch die Infektiosität verloren geht.
Im adaptiven Immunsystem werden einige T- und B-Zellen zu Gedächtniszellen, die sich an spezifische Erreger „erinnern“ können. Diese Gedächtniszellen lösen bei einer erneuten Exposition mit demselben Erreger eine viel schnellere Immunantwort aus. Um einen Mechanismus zu schaffen, der die Gedächtnisfunktion von B-Zellen nachahmt, haben wir uns daher der ssDNA TM zugewandt, die durch die Verdrängungsreaktion zwischen P0 und AM produziert wird und ab der ersten Exposition gegenüber P0 im System verbleibt. Wir beschreiben auch, wie sie die Verdrängungsreaktion zwischen P0 und BM katalysiert, um den Primer schnell freizusetzen und so eine schnellere RCA-Reaktion auszulösen, die Antikörper für die nächste Exposition mit der gleichen Erreger-Sequenz erzeugt. Diese Reaktion wird als entropiegetrieben definiert, da sie sich spontan in Richtung eines thermodynamischen Gleichgewichts entwickelt (ergänzende Abb. 7)18. Ohne TM würde die Verschiebungsrate zwischen P0 und BM durch die effektive Blockierung der aktiven Domänen auf BM verlangsamt. In Anwesenheit von TM kann BM jedoch über seinen 4 nt Toehold (Domäne 5*) mit TM hybridisieren und anschließend den ssDNA-Primer-Initiator (PI) und das Seitenprodukt W1 freisetzen, wodurch eine neue Toehold-Bindungsregion (Domäne 3*) für die Hybridisierung zwischen P0 und BM entsteht, die durch den entropischen Gewinn der freigesetzten Moleküle thermodynamisch vorwärts getrieben wird. Der Gedächtniseffekt entsteht also durch die Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit zwischen P0 und BM unter Ausnutzung des katalytischen Effekts des verbleibenden TM, der durch die anfängliche Erkennung entsteht. Indem TM als „katalytischer Treibstoff“ im System verbleibt, wird also ein Gedächtniseffekt für einen bestimmten Erreger-Input erzielt.
Verifizierung der Signaltransduktion
Um die korrekte Funktion des gesamten Netzwerks zu gewährleisten, wurde die Signaltransduktion auf jeder Stufe separat validiert. Um die Genauigkeit der Schwellenwertfunktion von AM zu untersuchen, verwendeten wir eine Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierte Methode, um die Hybridisierungsreihenfolge von P0 mit AM und BM zu untersuchen. Ein Paar aus Fluorophor (Fluorescein (FAM)) und Quencher (DABCYL (DAB)) wurde in den PG-Duplex gekoppelt, um die freigesetzte Menge an Primer für die RCA-Reaktion anzuzeigen. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz erfolgt nur, wenn der Schwellenwert von AM überschritten wird, woraufhin die Reaktion zu Schritt 2, der Immunantwort, übergeht, die auf Strangverdrängungsreaktionen basiert, die den Quencher-markierten Primerstrang freisetzen können. Daher wurden in Gegenwart von 80 nM AM, 100 nM BM und 100 nM fluorophor-/quencher-markiertem PG verschiedene Konzentrationen von P0 (von 0 bis 150 nM) in das System eingebracht und die Fluoreszenz bei 517 nm überwacht. Wie in Abb. 2b gezeigt, zeigte die Fluoreszenzwiederherstellung einen starken Anstieg bei der P0-Konzentration von 80 nM, aber nur einen geringen Anstieg unterhalb von 80 nM, was darauf hinweist, dass die Reaktion zwischen P0 und BM am Verarmungspunkt von AM begonnen hatte. Mit anderen Worten, der Schwellenwert von AM zu P0 ist durch Änderung der Konzentration von AM einstellbar. In diesem Fall wurde der Erschöpfungspunkt oder Schwellenwert von AM bei 80 nM erreicht, was darauf hindeutet, dass die Reaktion zwischen P0 und BM Schritt 2 einleiten konnte, der beim Menschen die Produktion von Antikörpern durch B-Lymphozyten ist. Um dieses Ergebnis weiter zu bestätigen, wurde die Fluoreszenzkinetik des obigen Systems überwacht. Zu Beginn wurden 80 nM AM, 100 nM BM und 100 nM PG im Puffer gemischt und eine kleine Menge P0 (30 nM) zugegeben. Infolge der überschüssigen Menge an AM und seiner Reaktionspriorität zu P0 durch die Anforderungen von Schritt 1 kam es zu einer langsamen Kinetik der Fluoreszenzwiederherstellung. Wenn jedoch kontinuierlich mehr P0 (jeweils 30 nM) zum System hinzugefügt wurde, war ein starker Anstieg (nach insgesamt 90 nM) in der Fluoreszenzkinetik zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die Reaktion zu Schritt 2 übergehen konnte. Verschiedene Schwellenwerte wurden durch Veränderung der Konzentrationen von AM und BM getestet (ergänzende Abb. 1). Die Gelelektrophorese wurde ebenfalls verwendet, um die Reihenfolge der Reaktionen anzuzeigen (ergänzende Abb. 2). Da die gleiche Erkennungsdomäne (2-3-4) geteilt wird, wurden ähnliche experimentelle Ergebnisse auch beobachtet, indem P0 durch eine andere Erregersequenz, P0-SARS (genomische DNA des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus), ersetzt wurde (ergänzende Abb. 3). Alle Assays bestätigten die effektive Schwellenfunktion von AM in Bezug auf die Reaktion zwischen BM und P0 und lieferten somit eine makroskopische Mimikry des „Erkennungs- und Toleranz“-Zustands von AIS.
a, Schema der Reaktionsschritte, die in den Schritten 1 und 2 auftreten. W2 ist das Nebenprodukt aus der Verdrängungsreaktion von PI und PG. b, Plot der Fluoreszenzwiederherstellung des Systems mit 80 nM AM, 100 nM BM und 100 nM FAM/DAB-markiertem PG mit verschiedenen Konzentrationen des ssDNA-Erregers P0. c, Kinetik-Experimente des Systems mit 80 nM AM, 100 nM BM und 100 nM FAM/DAB-markiertem PG. Zu jedem Zeitpunkt wurden 30 nM P0 separat in den Puffer gegeben. d, Kinetik-Experimente zur Untersuchung des katalytischen Effekts von TM. Die schwarze Kurve zeigt die Hintergrundkinetik mit 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-markiertem PG und keinem P0. Die rote Kurve zeigt die unkatalysierte Reaktionskinetik mit 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-markiertem PG und 150 nM P0. Die blaue Kurve zeigt die katalysierte Reaktionskinetik mit 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM FAM/DAB-markiertem PG und 150 nM P0. Die Experimente wurden bei 25 °C in 50 mM Tris-HCl-Puffer durchgeführt, der 10 mM MgCl2 enthielt. a.u., arbiträre Einheiten.
Eine weitere wichtige Funktion von AM ist die Produktion von katalytischem ssDNA TM, um die Hybridisierungsreaktion zwischen P0 und BM zu erleichtern, was nach Zhang et al.18, Zhang et al.18 zufolge die Hybridisierungsreaktion um zwei bis vier Größenordnungen beschleunigen kann. ssDNA TM ist nicht nur wichtig für die Erleichterung der Hybridisierung zwischen P0 und BM, sondern auch der Schlüssel für die Bildung von „mimetischen Gedächtniszellen“. Um den katalytischen Effekt von TM nachzuweisen, verwendeten wir daher weiterhin unser FRET-basiertes Berichtsmodell, wie oben beschrieben. Entsprechend wurden 80 nM AM, 100 nM BM und 100 nM FAM/DAB-markiertes PG in Puffer inkubiert. Anschließend wurden dem System 150 nM P0 zugesetzt. Zur Überwindung des Schwellenwerts wurde ein Überschuss an P0 zu AM verwendet. TM wird in Schritt 1 als Ergebnis der Reaktion zwischen P0 und AM erzeugt. Somit führt P0, wenn es den Schwellenwert überschreitet (wie durch die Steuerung der Konzentration von AM eingestellt), seinerseits zu einer katalytischen Reaktion zwischen überschüssigem P0 und TM durch Entropie, die die Fluoreszenz des Systems schnell wiederherstellen kann. Zum Vergleich wurde die gleiche Konzentration von P0 direkt zu einer Lösung mit 100 nM BM und 100 nM FAM/DAB-markiertem PG, aber ohne AM, gegeben. Wie in Abb. 2d gezeigt, zeigten Messungen der Fluoreszenzkinetik der katalysierten Reaktion eine über 500-fache Beschleunigung im Gegensatz zu derjenigen ohne Katalyse18,20. Somit könnte, wie oben erläutert, das freigesetzte TM als spezifische Gedächtnismimikry dienen, was zu einer stärkeren und schnelleren Immunantwort bei der nächsten Exposition gegenüber demselben Pathogen führt. Anschließend bestätigten wir auch, dass die Menge an P*, die bei der enzymatischen Amplifikation für die Hybridisierung mit der Domäne P in P0, P1 und P2 erzeugt wird, durch die Menge an Primer bestimmt werden kann, wodurch die enzymatische Reaktion durch vorgeschaltete Reaktionen in den Schritten 1 und 2 steuerbar wird (siehe ergänzende Informationen). Zusätzlich wurde der Restriktionsenzym-basierte Verdau des generierten Antigen-Antikörper-Komplexes untersucht und ist in den ergänzenden Informationen dargestellt.
Gesamtsystemleistung
Nachdem wir die korrekte Funktion der einzelnen Schritte bestätigt hatten, testeten wir die Leistung des Gesamtsystems mit dem gleichen Erregerstrang-Input aus dem B. anthracis-Genom (P0) weiter. Um die Toleranz von AIRS zu bestätigen, wurde dann eine kleine Menge P0 (100 nM) zum System hinzugefügt und die Fluoreszenz in Echtzeit überwacht. Als nächstes entwarfen wir einen molekularen DNA-Leuchtturm (MB-R), um die Menge des RCA-Produkts fluoreszierend zu melden, indem wir die pathogene B. anthracis-Genomsequenz P als Schleife verwendeten. MB-R konnte von den RCA-Produkten, d. h. P*, geöffnet werden und dadurch eine Fluoreszenzwiederherstellung aufweisen, die unterschiedliche Mengen von P* repräsentiert. Abbildung 3a zeigt, dass die Fluoreszenzkinetik ähnlich der ohne P0 ist, was bestätigt, dass das System nicht aktiviert wird, um P* zu produzieren, wenn die Erregermenge unter dem Niveau der Immuntoleranz liegt (d. h. ein Schwellenwert von 200 nM). Als jedoch weitere 150 nM P0 zu dem System hinzugefügt wurden, um eine zweite Exposition mit demselben Pathogen zu imitieren, zeigte die Fluoreszenzwiederherstellung ein viel schnelleres Kinetikverhalten, was auf die Produktion einer großen Menge an P* und eine erfolgreiche Auslösung der Immunantwort hinweist. Darüber hinaus bestätigt die schnellere Reaktion bei der zweiten Exposition auch den Memory-Effekt dieses Systems für einen bestimmten Erreger. Wenn P0-SARS als Erreger-Input und ein mit P0-SARS kodierter molekularer Leuchtturm (MB-R-SARS) als Reporter verwendet wird, zeigen sich ähnliche Fluoreszenz-Antwort-Trends, wie in Abb. 3b gezeigt, was darauf hinweist, dass AIRS potenziell für einen zweiten Erreger-Input funktioniert. Wir haben auch ein anderes Fluoreszenz-Reportersystem verwendet, um die Menge des erzeugten P* anzuzeigen, was in der ergänzenden Abb. 10 gezeigt ist.
a,b, Die Fluoreszenzkinetik der P*(P*-SARS)-Generierung der Antikörper-Mimikry wurde mit verschiedenen Konzentrationen von P0 (a) und P0-SARS (b) verfolgt. Hier haben wir die doppelte Menge der einzelnen DNA-Komponenten im Vergleich zu den in Abb. 2 gezeigten Daten verwendet, um sicherzustellen, dass die Konzentrationen mit dem Gelexperiment übereinstimmen.
Unter Verwendung eines Fluoreszenzreporters in unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass AIRS mit zwei verschiedenen Erreger-Inputs gleich gut funktioniert. Daher haben wir als nächstes untersucht, ob es auch funktioniert, wenn zwei verschiedene Inputs gleichzeitig präsentiert werden. Um diese Bestimmung durchzuführen, wurden P0 und P0-SARS zusammen in eine Lösung gegeben, die alle Komponenten enthielt (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0,5 U μl-1 Phi29 und 250 μM dNTP). Wie im obigen Experiment wurden auch hier zwei verschiedene molekulare Baken mit dem gleichen Fluorophor und Quencher (MB-R und MB-R-SARS) zugegeben, um die Mengen der beiden RCA-Produkte, also P* und P*-SARS, fluoreszierend anzuzeigen. Wie in der ergänzenden Abb. 14 zu sehen ist, wird AIRS nicht aktiviert, solange beide Erregereinträge unter dem Niveau der Immuntoleranz (Schwellenwert von 300 nM) liegen, und die Fluoreszenz bleibt im Vergleich zum Hintergrundsignal unverändert. Wenn die Konzentrationen jedoch auf ein Niveau ansteigen, das über dem Schwellenwert für einen oder beide Erreger liegt, wird die Fluoreszenz wiederhergestellt, was darauf hinweist, dass beide Erreger-Inputs eine entsprechende Antikörper-Mimikry erzeugen können, wenn sie zusammengemischt werden. Dies bestätigt, dass AIRS in der Lage ist, gleichzeitig auf zwei verschiedene Pathogen-Inputs zu reagieren.
Um den fehlerfreien Betrieb des AIRS-Systems weiter zu charakterisieren, haben wir die Gelelektrophorese zur Analyse der endgültigen P*-Menge verwendet. Wie in Abb. 4a gezeigt, ist nur eine scharfe Bande mit hohem Molekulargewicht zu sehen, wenn die Erregermenge den Schwellenwert (100 + 150 nM) überschreitet, was mit den vorherigen Fluoreszenzergebnissen übereinstimmt. Um die Bindung zwischen dem Erreger-Eingabestrang (P0) und dem Antikörper-Mimikry-Strang (P*) in Schritt 3 zu untersuchen, modifizierten wir P0 mit einem Fluorophor (FAM). Nach der Erzeugung von P* wurde die Hybridisierung zwischen P0 und P* bestätigt, da eine Bande mit hohem Molekulargewicht im Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Bildkanal zu sehen war (ergänzende Abb. 13). Bei Zugabe von mehr FAM-markiertem P0 (von einem bis 250 Überschuss) zum System wurde die Hybridisierung zwischen überschüssigem P0 und generiertem P* immer noch beobachtet, was darauf hindeutet, dass AIRS den überschüssigen Erreger-Eingangsstrang (P0) durch RCA ausreichend binden konnte. Schließlich inkubierten wir das Restriktionsenzym (2 U µl-1) zusammen mit allen anderen Komponenten (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 und 250 µM dNTP). Nach Einführung einer Überkonzentration von FAM-markiertem P0 (500 nM), um die Immuntoleranz des Systems zu überschreiten, wurde unter dem FITC-Kanal eine Verdauungsfragmentbande mit einer FAM-Modifikation (56 nt) entdeckt, was auf eine erfolgreiche Verdauung des Pathogens schließen lässt (Abb. 4b). Interessanterweise kann, wenn P0 durch einen Doppelnukleotid-Polymorphismus-Eingang (P0-mis) ersetzt wird, immer noch eine Antikörper-Mimikry P* mit einer Überkonzentration von P0-mis erzeugt werden. Die Hybridisierung zwischen P0-mis und P* kann jedoch nicht durch das Restriktionsenzym SspI verdaut werden, was zeigt, dass das AIRS-System empfindlich auf die Erkennung des Nukleotidpolymorphismus des Erregereingangs reagiert (ergänzende Abb. 11). AIRS wurde mit zwei Selektivitätsebenen konzipiert, was es dem System ermöglicht, P0 von einem Input mit doppeltem Nukleotidpolymorphismus, P0-mis, zu unterscheiden. Zur Erklärung: Die relativ schwächere Bindungsfähigkeit zwischen P0-mis und P* im Vergleich zu derjenigen zwischen P0 und P* macht den P0-mis-P*-Duplex weniger stabil. Zusätzlich kann ein P0-mis-P*-Mismatch-Duplex keine effektive Erkennungsbindungsstelle mit dem Restriktionsenzym SspI (AAT-ATT) bilden und dadurch die Verdauungsrate des Enzyms reduzieren, was wiederum zu viel weniger Spaltprodukt aus dem eingegebenen P0-mis führt (ergänzende Abb. 11). Da die Hybridisierung von P0-SARS mit P* eine Erkennungsbindungsstelle erzeugt, die mit der des Restriktionsenzyms SspI identisch ist, wurden dagegen ähnliche Gelelektrophorese-Ergebnisse gefunden (Abb. 4c), was wiederum bestätigt, dass AIRS für unterschiedliche Pathogen-Inputs funktionieren kann.
a, Analyse der Antikörper-Mimikry P*-Generation mittels Agarosegel (1,5%). L, 100-Basen-Paar-Leiter. Das Bild wurde unter einem Ethidiumbromid (EB)-Bildgebungskanal aufgenommen (λAnregung = 520 nm, λEmission = 605 nm). b, Validierung der Leistung des AIRS-Analogsystems mit dem Erregerstrang P0 durch Agarosegel (1%). M ist die Mischung der ursprünglich vorhandenen Komponenten im AIRS. Hier M = Mischung aus 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 und 250 µM dNTP; Inkubationszeit, eine Stunde. Lane 1, M + 0 nM FAM-markiertes P0; Lane 2, M + 100 nM FAM-markiertes P0; Lane 3, M + 500 nM FAM-markiertes P0; Lane 4, M + 100 nM FAM-markiertes P0 + 2 U µl-1 SspI; Lane 5, M + 500 nM FAM-markiertes P0 + 2 U µl-1 SspI; L, 1 kb-Leiter. c, Validierung der Leistung des AIRS-Analogsystems mit dem Erregerstrang P0-SARS mittels Agarosegel (1%). M = Mischung aus 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0,5 U µl-1 Phi29 und 250 µM dNTP; Inkubationszeit, eine Stunde. Lane 1, M + 0 nM FAM-markiertes P0-SARS; Lane 2, M + 100 nM FAM-markiertes P0-SARS; Lane 3, M + 500 nM FAM-markiertes P0-SARS; Lane 4, M + 100 nM FAM-markiertes P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; Lane 5, M + 500 nM FAM-markiertes P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; L, 1 kb-Leiter.
Schließlich hängt, wie oben erwähnt, die Spezifität des Systems hauptsächlich vom Restriktionsenzym und der Sequenz von CT ab (siehe ergänzende Informationen). Als wir das System herausforderten, indem wir FAM-markierte P0-SARS als pathogenen Input, aber CT für B. anthracis als Amplifikations-Template einführten, erschien keine offensichtliche Fluoreszenzbande mit hohem Molekulargewicht, weder mit kleinen noch mit großen Mengen von P0-SARS unter dem FITC-Kanal, weil es keine Hybridisierung zwischen P0-SARS und P* gab, die spezifisch für B. anthracis erzeugt wurde (ergänzende Abb. 12).