Forschungsdesign und Methoden
Nicht-invasive Glukosemessgerät-Technologie
Die für das Glukosemessgerät verwendete Technologie basiert auf dem Prinzip, dass der menschliche Körper von Natur aus starke elektromagnetische Strahlung im Mikrometer-Wellenlängenbereich aussendet und der Entdeckung, dass diese Strahlung spektrale Informationen von Gewebeanalyten enthält. Obwohl diese patentierte Technologie für die Messung verschiedener Substanzen im menschlichen Körper eingesetzt werden kann, ist zunächst geplant, sie in einem Blutzuckermessgerät zu verwenden, da es einen erheblichen ungedeckten Bedarf gibt, die derzeitigen Messmethoden zu ersetzen.
Der menschliche Körper sendet starke elektromagnetische Strahlung aus. Die Gesetze der Physik besagen, dass alle Objekte IR-Strahlung emittieren und dass die Intensität der Strahlung und die spektrale Charakteristik des Objekts durch seine absolute Temperatur sowie durch die Eigenschaften und Zustände des Objekts bestimmt werden.
Das Plancksche Gesetz (19) beschreibt einen Zusammenhang zwischen Strahlungsintensität, Spektralverteilung und Temperatur des Schwarzen Körpers. Der menschliche Körper ist ein hervorragender Schwarzer Körper, der Licht im mittleren IR-Bereich genau im richtigen Spektralbereich emittiert. Die spektrale Charakteristik der thermischen Emission wird von der individuellen Gewebezusammensetzung und den Analytkonzentrationen beeinflusst. Das Kirchhoff’sche Gesetz bestätigt, dass für den gesamten Körper bei gleicher Temperatur und gleicher Wellenlänge das Absorptionsvermögen gleich dem monochromatischen Emissionsvermögen ist.
Sensoren für Analytmessungen sollten die erforderliche Empfindlichkeit und Selektivität, Sterilisierbarkeit und Langzeitstabilität aufweisen. Spektroskopische Sensoren können alle diese Anforderungen erfüllen. Unter den verschiedenen Spektralbereichen bietet die Mittelinfrarotspektroskopie aufgrund des Informationsgehalts des Fingerprint-Bereichs eine höhere Empfindlichkeit und Selektivität. Die Selektivität dieser Technologie basiert auf dem gleichen Prinzip wie die Selektivität der Absorptionsspektroskopie-Methode für Analytmessungen. Glukose hat sehr gut definierte spektrale Eigenschaften im Fingerprint-IR-Bereich, wie z. B. in den Studien von Heise et al. und Vonach et al. und in unseren Plasmahitze-Emissionsspektren gezeigt wird (Abb. 2).
In einer einfachen Versuchsanordnung kann man zeigen, dass die Emission von Glukose mit Raumtemperaturdetektoren in einem filterbasierten Aufbau nachgewiesen werden kann. Ein speziell entwickeltes, nicht-dispersives, filterbasiertes Spektrometer (Abb. 1) führte Absorptions- und Emissionsmessungen durch. Ein Filterspektrometer hat den Vorteil der Einfachheit, eines hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, eines hohen Durchsatzes und geringer Kosten. Die drehbaren Filterräder mit charakteristischen Transmissionskurven erzeugen, wenn sie im Strahlengang platziert werden, variable Durchlassbänder mit geringer Auflösung. Als Filter wurde ein kreisförmiger variabler IR-Filter, Segment #3, des Optical Coating Laboratory mit einem Transmissionsband von 7,7 bis 14,1 μm verwendet. Die IR-Strahlung wurde von einem IR-Wellenleiter aus einem Rohr mit einer vergoldeten Innenfläche aufgefangen, der die IR-Strahlung in ein variables Filter in unmittelbarer Nähe leitete. Auf der anderen Seite des Filters wurde ein Thermopile-Detektor (Perkin Elmer/Heineman Modell TPS 434) auf der optischen Achse des Wellenleiters sehr nahe an der Filteroberfläche platziert. Die Kombination aus Wellenleiterdurchmesser, Öffnungsloch des Detektors und der Größe seines empfindlichen Bereichs wirkte wie ein Spalt in der Standardspektrometrie mit <0,2-μm-Spektralauflösung. Nützliche spektrale Dateninformationen wurden im Bereich von 9-13 μm gefunden, dank der Kombination aus dem Kanteneffekt an den Enden des Filters und der Auflösung aufgrund der Spaltbreite. Mindestens sechs Spektren wurden gemittelt, und das Fourier-Verfahren mit Sechs-Punkt-Glättung wurde verwendet, um schnelles Rauschen aus dem Spektrum zu entfernen. Sowohl die Transmissions- als auch die Emissionsspektren (nach Korrektur für die thermische Hintergrundemission des Instruments) wurden durch die theoretischen Strahlungsintensitätswerte des Schwarzen Körpers geteilt, was zu Werten führt, die proportional zum Absorptionsvermögen und zum monochromatischen Emissionsvermögen sind. Die gemessenen Änderungen des monochromatischen Emissionsgrades lagen im Bereich von 10-4 und damit immer noch oberhalb der Rauschgrenze des Systems. Als Beispiel zeigt Abb. 2A die thermischen (bei 41°C) IR-Emissionsspektren (obere Kurve) von Glukose in einer KBr (Kaliumbromid)-Tablette mit einem Transmissionsspektrum (untere Kurve) zum Vergleich. Selbst bei diesen qualitativ schlechten Spektren kann man entsprechende Banden der Glukoseabsorption beobachten, z. B. eine Hauptbande bei 9,6 μm, eine Bande bei 10,9 μm (entsprechend dem 914 cm-1 Schwingungszustand der Glukose) und eine schwächere Bande um 12 μm. Man kann ein typisches Spiegelbild zwischen den Transmissions- und Emissionsspektren erkennen. Das reine Glukose-IR-Spektrum weist auf fundamentale Glukose-Signatur-Spektralbanden hin.
Die thermischen IR-Emissionscharakteristika verschiedener Glukosekonzentrationen in Wasser und menschlichen Plasmalösungen wurden gemessen. Nach unserem Wissen ist dies das erste Mal, dass über solche Messungen berichtet wurde. Die Ergebnisse für die IR-Emission des menschlichen Plasmas bei 37°C sind in Abb. 2B dargestellt. Diese Abbildung hebt zwei wichtige Merkmale hervor: Erstens zeigt sie den interessierenden Spektralbereich und zweitens stellt sie den experimentellen Beweis für die Fähigkeit der aktuellen IR-Detektoren zur Erkennung thermischer Emission bei Raumtemperatur dar. Die Entfaltung zeigt Banden, die empfindlich und unempfindlich auf Änderungen der Glukosekonzentration im menschlichen Plasma reagieren. Zur Verdeutlichung sind die Spektren entlang der vertikalen Achse nach oben verschoben. Die Ergebnisse der Entfaltung in der eingefügten Tabelle zeigen die Peakintensitätsänderungen in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration. Auch hier kann man in der Emission die entsprechenden Banden der Glukoseabsorption beobachten, z. B. eine Hauptbande bei 9,8 μm, eine Bande bei 10,9 μm (entsprechend dem Schwingungszustand von Glukose bei 914 cm-1) und eine schwächere Bande um 11,9 μm.
Die Wärmestrahlung des menschlichen Körpers enthält Informationen über die spektralen Eigenschaften des Objekts und wird durch die absolute Körpertemperatur sowie durch die Eigenschaften und Zustände der emittierenden Körpergewebe bestimmt. Daraus kann man schließen, dass die spektralen Eigenschaften von Blut mit unterschiedlichem Gehalt an Glukose (oder anderen Analyten) den Emissionsgrad des Trommelfells verändern und es ermöglichen, die Konzentration von Glukose im Blut zu messen.
Das Trommelfell ist bekanntermaßen in einer hervorragenden Position, um die Körpertemperatur zu messen, da es seine Blutversorgung mit dem Hypothalamus teilt, dem Zentrum der Körperkerntemperaturregulation. Ein Trommelfellthermometer misst die integrale Intensität (über alle Wellenlängen) der IR-Wärmestrahlung. Ein Sensor, der in den Gehörgang eingeführt wird, kann eine klare Sicht auf die Membran und ihre Blutgefäße erhalten, um die Menge der IR-Strahlung zu messen, die die Membran abgibt. Im Vergleich zur theoretischen Schwarzkörperstrahlung, die durch das Plancksche und Kirchhoffsche Gesetz beschrieben wird, wird diese IR-Strahlung durch die Gewebezusammensetzung spektral modifiziert. So hat die IR-Strahlung spektrale Eigenschaften von z.B. Blut im Trommelfell.
In diesem Gerät wurden die spektralen Eigenschaften verschiedener Bestandteile des Blutes mit Methoden der analytischen Chemie-Spektroskopie getrennt. Das Gerät basiert auf dem Einsatz von IR-Filtern, die vor IR-Detektorfenstern platziert sind. Ein Filter lässt die Strahlung durch die thermischen Emissionsbanden mit Glukosesignaturen hindurch und wird in einem der IR-Detektorfenster platziert, während das andere IR-Detektorfenster von einem Filter abgedeckt wird, der in der Lage ist, Strahlung durchzulassen, die keine für den Analyten charakteristischen Emissionsbanden bei Wellenlängen im interessierenden Bereich enthält. Ein Vergleich der Strahlungsintensität zwischen den beiden Detektorfenstern (wie in Abb. 3 dargestellt) liefert einen Messwert, der proportional zur Analytkonzentration ist und mit der Konzentration von BG korreliert werden kann.
Abbildung 3 zeigt eine vereinfachte Darstellung des Geräts. Das Gerät empfängt optisch IR-Strahlung vom Objekttarget, wie z. B. einem Trommelfell. Das Erfassungssystem besteht aus einem optischen IR-Filtersatz und einem Thermopile-Detektor, der im IR-Bereich der menschlichen Körperstrahlung empfindlich ist. Eines der Sensorelemente wird durch einen IR-Filter abgedeckt, der für die IR-Glukosesignatur empfindlich ist, während ein entsprechender Filter, der keine für den gemessenen Analyten charakteristischen Spektralbänder aufweist, den anderen Sensorbereich abdeckt. In unserem Prototyp-Design wurde ein sogenannter quasi-isosbestischer Punkt bei etwa 8,5 μm für Referenz-Emissionsintensitätsmessungen und 9,6 μm für Glukosesignaturmessungen verwendet. Spektral modifizierte IR-Strahlung aus dem Trommelfell beleuchtet beide Fenster. Die Differenz der Strahlungsintensität zwischen den beiden Strahlungspfaden liefert ein Maß, das proportional zur Analytkonzentration ist.
Klinisches Studiendesign
Das University of Connecticut Institutional Review Board genehmigte die Studie, und alle Probanden gaben vor der Teilnahme eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Insgesamt wurden 5 Frauen und 26 Männer mit insulinpflichtigem Diabetes im Alter von 18 bis 75 Jahren in die Studie aufgenommen. Zwei eingeschriebene Probanden wurden von der Studie ausgeschlossen. Einer hatte einen schlechten venösen Zugang und der andere hatte eine Serumglukosekonzentration >400 mg/dl zu Beginn der Studie und benötigte eine medizinische Behandlung. Gepaarte Glukosemessungen der ersten 23 Probanden wurden verwendet, um die nicht-invasive Monitormessung der Trommelfell-Glukosekonzentration mit der Serum-Glukosekonzentration aus einer antecubitalen Vene zu kalibrieren. Diese Kalibrierung wurde anschließend durch den Vergleich der Trommelfell-Glukosekonzentrationen mit den Serum-Glukosekonzentrationen bei sechs Probanden getestet.
Am Morgen der Studie nahmen die Probanden weiterhin ihre üblichen Medikamente ein, nahmen aber kein Insulin und frühstückten nicht. Der Gehörgang jedes Probanden wurde untersucht, um sicherzustellen, dass das Trommelfell frei von Cerumen war. Bei vier Probanden wurde das Trommelfell mit warmem Wasser gespült, um Cerumen zu entfernen, das das Trommelfell verstopft hatte. Ein intravenöser Zugang wurde in eine antekubitale Vene gelegt und mit 0,45%iger Kochsalzlösung offen gehalten. Bei 0 min und alle 10 min für insgesamt 210-250 min wurden 3 ml Blut zur Messung der Serumglukosekonzentration entnommen. Eine Messung der Trommelfell-Glukosekonzentration wurde unmittelbar nach Abschluss der Phlebotomie durchgeführt. Das übliche langwirksame Insulin des Probanden wurde bei 0 min verabreicht, ein kohlenhydratkonsistentes Diätfrühstück wurde bei 30 min verabreicht, und der übliche Insulinbolus des Patienten wurde bei 90 min abgegeben. Für die Probanden, die normalerweise keinen Insulinbolus verwenden, wurde der Bolus vom betreuenden Arzt festgelegt, um die Serumglukosekonzentration bis zum Ende der Studie zu normalisieren. Der betreuende Arzt kannte die Ergebnisse der Serumglukosemessungen und griff bei Serumglukosekonzentrationen >400 mg/dl oder <60 mg/dl klinisch angemessen ein. Die Umgebungstemperatur wurde zwischen 18 und 25°C gehalten. Die orale Temperatur des Probanden, die Raumtemperatur und die Raumluftfeuchtigkeit wurden bei 0 min und alle 30 min bis zum Ende der Studie aufgezeichnet. Der Bereich der relativen Raumluftfeuchtigkeit lag während der Experimente zwischen 20 und 60 %. Die Messungen der IR-Ohrtemperatur wurden 2 min nach jeder Glukosemessung durchgeführt. Die Krankenschwester, die die Messungen durchführte, war blind gegenüber den Serum-Glukosekonzentrationen des Trommelfells.
Gesamt 432 gepaarte Datenpunkte von 20 Probanden wurden für die Kalibrierung der Trommelfell-Glukosekonzentration mit der Serum-Glukosekonzentration verwendet. Eine geschulte Krankenschwester führte die Messungen der Trommelfell-Glukosekonzentration bei 19 dieser Probanden durch. Vier Probanden wurden geschult und führten die Messungen der Trommelfell-Glukosekonzentration selbst durch. Es standen zwei Monitore zur Verfügung. Im Kalibrierungsmodus wurde der primäre Monitor für 16 Probanden verwendet. Der Backup-Monitor wurde für vier Probanden verwendet.
Die Ergebnisse von drei Probanden wurden nicht in die Kalibrierungsanalyse einbezogen. Die Ergebnisse von einem Probanden, der seine eigenen Messungen durchführte, und von zwei weiteren Probanden (mit Messungen, die von einer Krankenschwester durchgeführt wurden) wurden verworfen, da die Messwerte nicht den Kriterien entsprachen, die für die Akzeptanz der Daten von nicht-invasiven Geräten festgelegt wurden (siehe Methoden der Datenanalyse). Für diese drei Probanden wurde der primäre Monitor verwendet. Nach der Kalibrierung des nicht-invasiven Geräts wurde das Studienprotokoll in einer blinden, prospektiven Weise an sechs Probanden durchgeführt, die alle den primären Monitor verwendeten. Der Beobachter, der die Trommelfell-Glukosekonzentration berichtete, und der Beobachter, der den Bericht über die Serum-Glukosekonzentration erhielt, waren blind für die Ergebnisse der ergänzenden Messung. Alle berichteten Datenpunkte wurden in die Datenanalyse der sechs prospektiv untersuchten Probanden einbezogen.
Methoden der Datenanalyse
Die Studien des nicht-invasiven Glukosemonitors wurden in zwei Teile geteilt. Im ersten Teil wurde der Monitor mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells mit den Daten der ersten Probandengruppe kalibriert. Im zweiten Teil wurden die prospektiven Studien zur Validierung der Kalibrierung und der verwendeten Methode durchgeführt.
Im ersten Teil des Experiments hatte der Beobachter, der die Trommelfell-Glukosekonzentration meldete, Zugang sowohl zu den invasiven als auch zu den nicht-invasiven Messungen. Die Daten von 23 Probanden (511 gepaarte Datenpunkte) wurden für die Kalibrierung des Monitors gesammelt. Bei der Analyse der Kalibrierungsdaten wurde festgestellt, dass bei drei Probanden >50 % der Messungen (22-25 Messungen wurden bei einem einzigen Probanden durchgeführt) einen Instrumentenfehler aufwiesen, während bei den anderen Probanden keine oder nur wenige Fehler auftraten. Ein Instrumentenfehler wurde angezeigt, wenn ein Signal vom Detektor des Monitors nicht gleichmäßig war (der interne Wert eines Signals vom Detektor ändert sich >20% für einige von 60 aufeinanderfolgenden gemessenen Datenpunkten pro einmaligem Einführen des Monitors in den Gehörgang des Probanden) oder das Detektorsignal außerhalb des Bereichs lag, wie in der Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur und der Raumfeuchtigkeit definiert. Die Häufung der Fehler bei diesen drei Probanden deutete auf einen grundsätzlichen Fehler hin, der auf medizinische Gründe (z. B. mögliche spektrale Interferenzen mit anderen Analyten, die spezielle Studien erfordern, oder ein nicht gerader oder gut begradigter Gehörgang) oder auf das Messverfahren zurückzuführen war (der Gehörgang wurde durch die Messspitze des Geräts nicht richtig abgedichtet, die Messspitze wurde nicht entlang der Achse von Gehörgang und Trommelfell platziert, oder es trat ein technischer Fehler bei der Handhabung der Messungen auf). Diese drei Probanden wurden als Dateneingabe für die Kalibrierung eliminiert. Für die endgültige Kalibrierung wurden 20 Probanden verwendet (insgesamt 432 gepaarte Datenpunkte ohne Gerätefehler), wobei bei 13 Datenpunkten (2,9 % von 445 Gesamtpunkten) Gerätefehler angezeigt wurden. Basierend auf den Kalibrierungsergebnissen wurde von einem Statistiker des University of Connecticut Health Center eine Power-Analyse der oben genannten Daten durchgeführt, die ergab, dass vier bis sechs Probanden benötigt werden, um einen prädiktiven Messmodus für die Validierung der Kalibrierung des nicht-invasiven Glukosemessgeräts zu erzeugen.
Im zweiten Teil des Experiments wurden vollständig prädiktive Messungen durchgeführt. Der Beobachter, der die Trommelfell-Glukosekonzentration meldete, war blind gegenüber den Ergebnissen der Labor-Serum-Glukosekonzentrationen. Die Schätzungen durch invasive und nicht-invasive Methoden wurden unabhängig voneinander vorgenommen. Bei den sechs Probanden zeigte das Gerät vier Messfehler an (3,1 % von insgesamt 130 gepaarten Datenpunkten). Sobald eine Schätzung vorgenommen und gemeldet wurde, wurden keine Punkte verworfen. Dieser zweite Teil zielte darauf ab, die Reproduzierbarkeit der Methodik zu demonstrieren, sobald die Kalibrierung des Glukosemonitors etabliert war.
Eine abschließende statistische Analyse der Ergebnisse aus den nicht-invasiven BZ-Monitor-Studien wurde mit einer Fehler-in-Variablen-Methode (auch „orthogonale Regression“ genannt) durchgeführt. Die gewöhnliche Kleinstquadrat-Regression geht davon aus, dass nur die Messungen der y-Koordinate mit zufälligen Messfehlern behaftet sind. Es ist oft der Fall, dass Unsicherheiten in den Daten sowohl bei den x- als auch bei den y-Koordinaten liegen. Dies ist der Fall, wenn sowohl x als auch y beobachtete Größen sind und daher bekannt sind, dass sie Fehler haben. Das Fehler-in-Variablen-Modell berücksichtigt die Messfehler für beide Sätze von Messungen. Zu solchen Modellen gehören Deming (20), die Methode von Passing und Bablok (21) und die orthogonale Regression. Die Deming-Methode erfordert die Angabe des Verhältnisses zwischen den quadrierten SDs für zwei beobachtete Größen, erlaubt aber nicht die Verwendung unterschiedlicher SDs über den Bereich der x- oder y-Messgrößen. Die meisten orthogonalen Regressionsverfahren verteilen den Fehler gleichmäßig über die x- und y-Koordinaten. In dieser Analyse von nicht-invasiven Monitorstudien wurde die orthogonale Regressionsmethode basierend auf einem von Reilly et al. (22) beschriebenen Algorithmus verwendet. Das obige Modell erlaubt es, den Messfehler für beide Achsen über den gesamten Bereich der gemessenen Größen einzuführen.
Labor-Serum-Glukose-Messungen
Die Labor-Serum-Glukose-Konzentration wurde mit der Methode der Sauerstoffverbrauchsrate unter Verwendung einer Sauerstoff-Elektrode (Synchron LX20 Instrument; Beckman Instruments, Brea, CA) bestimmt. Die SDs der Labormessungen, die vom klinischen Labor des University of Connecticut Health Center geliefert wurden, sind wie folgt: für Qualitätskontrollstufe 1 (QC1) mit einem mittleren BZ von 61 mg/dl, SD = ±2 mg/dl; für QC2 mit einem mittleren BZ von 120 mg/dl, SD = ±4 mg/dl; und für QC3 mit einem mittleren BZ von 373 mg/dl, SD = ±11 mg/dl. Der relative Fehler über den gesamten Bereich der Glukosekonzentrationen betrug etwa ±3,3 %.