Eisensulfide kommen in der Natur in Form von Eisen-Schwefel-Proteinen weit verbreitet vor.
Wenn organisches Material unter sauerstoffarmen (oder hypoxischen) Bedingungen zerfällt, wie z. B. in Sümpfen oder toten Zonen von Seen und Ozeanen, reduzieren sulfatreduzierende Bakterien verschiedene im Wasser vorhandene Sulfate und produzieren Schwefelwasserstoff. Ein Teil des Schwefelwasserstoffs reagiert mit Metallionen im Wasser oder im Feststoff und bildet Eisen- oder Metallsulfide, die nicht wasserlöslich sind. Diese Metallsulfide, wie z. B. Eisen(II)-sulfid, sind oft schwarz oder braun, was zu der Farbe von Schlamm führt.
Pyrrhotit ist ein Abfallprodukt der Desulfovibrio-Bakterien, einem sulfatreduzierenden Bakterium.
Wenn Eier lange gekocht werden, kann sich die Oberfläche des Dotters grün verfärben. Diese Farbveränderung ist auf Eisen(II)-Sulfid zurückzuführen, das sich bildet, wenn Eisen aus dem Eigelb mit Schwefelwasserstoff reagiert, der durch die Hitze aus dem Eiweiß freigesetzt wird. Diese Reaktion tritt bei älteren Eiern schneller auf, da das Eiweiß alkalischer ist.
Das Vorhandensein von Eisensulfid als sichtbarer schwarzer Niederschlag im Wachstumsmedium Pepton-Eisen-Agar kann verwendet werden, um zwischen Mikroorganismen zu unterscheiden, die das Cystein metabolisierende Enzym Cystein-Desulfhydrase produzieren und solchen, die dies nicht tun. Pepton-Eisen-Agar enthält die Aminosäure Cystein und einen chemischen Indikator, Eisen(III)-citrat. Beim Abbau von Cystein wird Schwefelwasserstoffgas freigesetzt, das mit dem Eisen(III)-citrat zu Eisensulfid reagiert.