Die Anzahl der Mikrotubuli, die an einem Kinetochor hängen, ist variabel: In Saccharomyces cerevisiae bindet nur ein MT an jeden Kinetochor, während bei Säugetieren 15-35 MTs an jeden Kinetochor gebunden sein können. Allerdings binden nicht alle MTs in der Spindel an einen Kinetochor. Es gibt MTs, die sich von einem Zentrosom zum anderen erstrecken (und die für die Spindellänge verantwortlich sind), und einige kürzere MTs sind zwischen den langen MTs eingeklinkt. Professor B. Nicklas (Duke University) zeigte, dass, wenn man die MT-Kinetochore-Befestigung mit einem Laserstrahl aufbricht, sich die Chromatiden nicht mehr bewegen können, was zu einer abnormalen Chromosomenverteilung führt. Diese Experimente zeigten auch, dass Kinetochoren eine Polarität haben und dass die Anheftung der Kinetochore an MTs, die von dem einen oder anderen Zentrosom ausgehen, von ihrer Orientierung abhängt. Diese Spezifität garantiert, dass sich nur eine Chromatide zu jeder Spindelseite bewegt und somit die korrekte Verteilung des genetischen Materials gewährleistet ist. Eine der grundlegenden Funktionen des Kinetochors ist also die MT-Verankerung an der Spindel, die für die korrekte Segregation der Schwesterchromatiden unerlässlich ist. Wenn die Verankerung nicht korrekt ist, kann es zu Fehlern kommen, die zu Aneuploidie führen, mit katastrophalen Folgen für die Zelle. Um dies zu verhindern, gibt es Mechanismen der Fehlererkennung und -korrektur (wie den Spindle Assembly Checkpoint), deren Komponenten sich ebenfalls an den Kinetochoren befinden. Die Bewegung eines Chromatids in Richtung Zentrosom wird in erster Linie durch die Depolymerisation von MT in der Bindungsstelle mit dem Kinetochor bewirkt. Diese Bewegungen erfordern auch eine Krafterzeugung, an der molekulare Motoren beteiligt sind, die sich ebenfalls auf den Kinetochoren befinden.
Chromosomenverankerung an MTs in der mitotischen SpindelBearbeiten
MTs einfangenBearbeiten
Während der Synthesephase (S-Phase) im Zellzyklus beginnt sich das Zentrosom zu verdoppeln. Gleich zu Beginn der Mitose erreichen beide Zentriolen in jedem Zentrosom ihre maximale Länge, die Zentrosomen rekrutieren zusätzliches Material und ihre Nukleierungskapazität für Mikrotubuli nimmt zu. Im weiteren Verlauf der Mitose trennen sich die beiden Zentrosomen, um die mitotische Spindel zu etablieren. Auf diese Weise hat die Spindel in einer mitotischen Zelle zwei Pole, von denen Mikrotubuli ausgehen. Mikrotubuli sind lange Proteinfilamente mit asymmetrischen Enden, einem „Minus“-Ende (-), das relativ stabil neben dem Zentrosom liegt, und einem „Plus“-Ende (+), das abwechselnde Phasen des Wachsens und Schrumpfens durchläuft und das Zentrum der Zelle erkundet. Während dieses Suchprozesses kann ein Mikrotubulus auf ein Chromosom stoßen und es über den Kinetochor einfangen. Mikrotubuli, die einen Kinetochor finden und festhalten, werden stabilisiert, während die Mikrotubuli, die frei bleiben, schnell depolymerisiert werden. Da Chromosomen zwei Kinetochore haben, die Rücken an Rücken assoziiert sind (einen auf jedem Schwesterchromatid), wird der Kinetochor auf dem Schwesterchromatid dem gegenüberliegenden Pol ausgesetzt, wenn sich einer von ihnen an die Mikrotubuli anlagert, die von einem der zellulären Pole erzeugt werden; Aus diesem Grund heftet sich der zweite Kinetochor meist an die Mikrotubuli, die vom gegenüberliegenden Pol ausgehen, so dass die Chromosomen nun bi-orientiert sind, eine Grundkonfiguration (auch als amphitelisch bezeichnet), die die korrekte Segregation beider Chromatiden bei der Zellteilung gewährleistet.
Wenn nur ein Mikrotubulus an einem Kinetochor verankert ist, setzt er eine schnelle Bewegung des zugehörigen Chromosoms in Richtung des Pols in Gang, der diesen Mikrotubulus erzeugt. Diese Bewegung wird wahrscheinlich durch die motorische Aktivität in Richtung des „Minus“ (-) des Motorproteins zytoplasmatisches Dynein vermittelt, das in den nicht an MTs verankerten Kinetochoren stark konzentriert ist. Die Bewegung in Richtung des Pols wird verlangsamt, soweit die Kinetochoren kMTs (an den Kinetochoren verankerte MTs) erreichen und die Bewegung wird durch Längenänderungen der kMTs gelenkt. Dynein wird von Kinetochoren freigesetzt, wenn diese kMTs erwerben, und ist in kultivierten Säugetierzellen für die Inaktivierung des Spindel-Checkpoints erforderlich, nicht aber für die Chromosomenkongression am Spindeläquator, den Erwerb von kMTs oder die Anaphase A während der Chromosomensegregation. In höheren Pflanzen oder in Hefe gibt es keine Hinweise auf Dynein, aber andere Kinesine zum (-)Ende hin könnten das Fehlen von Dynein kompensieren.
Ein weiteres Motorprotein, das in die anfängliche Einnahme von MTs involviert ist, ist CENP-E; dies ist ein hochmolekulares Kinesin, das mit der Faserkorona an den Kinetochoren von Säugetieren von der Prometaphase bis zur Anaphase assoziiert ist. In Zellen mit einem niedrigen Gehalt an CENP-E fehlt dieses Protein an den Kinetochoren der Chromosomen, die dann häufig nicht mehr in der Lage sind, sich an der Metaphaseplatte zu treffen. In diesem Fall können einige Chromosomen chronisch mono-orientiert (an nur einem Pol verankert) bleiben, obwohl die meisten Chromosomen korrekt an der Metaphasenplatte konvergieren können.
Es ist weithin akzeptiert, dass die kMTs-Faser (das Bündel von Mikrotubuli, das an den Kinetochor gebunden ist) durch das Einfangen von MTs entsteht, die an den Zentrosomen und Spindelpolen in kultivierten Säugetierzellen polymerisiert werden. Allerdings könnten auch MTs, die direkt an Kinetochoren polymerisiert werden, einen wichtigen Beitrag leisten. Die Art und Weise, wie die zentromerische Region oder Kinetochore die Bildung von kMTs initiieren und die Häufigkeit, mit der dies geschieht, sind wichtige Fragen, da dieser Mechanismus nicht nur zur anfänglichen Bildung von kMTs beitragen kann, sondern auch zu der Art und Weise, wie Kinetochore eine fehlerhafte Verankerung von MTs korrigieren und die Bewegung entlang von kMTs regulieren.
Rolle des Ndc80-Komplexes
MTs, die mit Kinetochoren assoziiert sind, weisen besondere Eigenschaften auf: Im Vergleich zu freien MTs sind kMTs viel resistenter gegenüber kälteinduzierter Depolymerisation, hohem hydrostatischen Druck oder Kalziumexposition. Außerdem werden kMTs viel langsamer recycelt als astrale MTs und Spindel-MTs mit freien (+) Enden, und wenn kMTs mit einem Laserstrahl von Kinetochoren gelöst werden, depolymerisieren sie schnell.
Wenn klar war, dass weder Dynein noch CENP-E für die Bildung von kMTs essentiell sind, sollten andere Moleküle für die Stabilisierung von kMTs verantwortlich sein. Genetische Pionierarbeiten in Hefe zeigten die Bedeutung des Ndc80-Komplexes für die Verankerung von kMTs. In Saccharomyces cerevisiae hat der Ndc80-Komplex vier Komponenten: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p und Spc25p. Mutanten, denen eine der Komponenten dieses Komplexes fehlt, zeigen einen Verlust der Kinetochor-Mikrotubuli-Verbindung, obwohl die Kinetochorstruktur nicht vollständig verloren geht. Mutanten, bei denen die Kinetochor-Struktur verloren geht (z. B. Ndc10-Mutanten in Hefe), sind jedoch sowohl in der Verbindung zu den Mikrotubuli als auch in der Fähigkeit, den Spindel-Checkpoint zu aktivieren, defizitär, wahrscheinlich weil Kinetochore als Plattform fungieren, in der die Komponenten der Reaktion zusammengebaut werden.
Der Ndc80-Komplex ist hoch konserviert und wurde in S. pombe, C. elegans, Xenopus, Huhn und Mensch identifiziert. Studien an Hec1 (highly expressed in cancer cells 1), dem menschlichen Homolog von Ndc80p, zeigen, dass es für die korrekte Chromosomenkongression und die mitotische Progression wichtig ist und mit Komponenten des Kohäsin- und Kondensin-Komplexes interagiert.
Verschiedene Laboratorien haben gezeigt, dass der Ndc80-Komplex essentiell für die Stabilisierung der Kinetochor-Mikrotubuli-Verankerung ist, die zur Unterstützung der zentromerischen Spannung erforderlich ist, die bei der Etablierung der korrekten Chromosomenkongression in hohen Eukaryonten eine Rolle spielt. Zellen mit beeinträchtigter Funktion von Ndc80 (durch RNAi, Gen-Knockout oder Antikörper-Mikroinjektion) haben abnormal lange Spindeln, fehlende Spannung zwischen Schwester-Kinetochoren, Chromosomen, die nicht in der Lage sind, sich an der Metaphase-Platte zu versammeln, und nur wenige oder gar keine assoziierten kMTs.
Es gibt eine Vielzahl von starken Belegen für die Fähigkeit des Ndc80-Komplexes, sich direkt mit Mikrotubuli zu assoziieren und die zentrale konservierte Komponente der Kinetochor-Mikrotubulum-Schnittstelle zu bilden. Die Bildung von robusten Kinetochor-Mikrotubuli-Interaktionen erfordert jedoch möglicherweise auch die Funktion zusätzlicher Proteine. In Hefe erfordert diese Verbindung die Anwesenheit des Komplexes Dam1-DASH-DDD. Einige Mitglieder dieses Komplexes binden direkt an MTs, während einige andere an den Ndc80-Komplex binden. Dies bedeutet, dass der Komplex Dam1-DASH-DDD ein essentieller Adapter zwischen Kinetochoren und Mikrotubuli sein könnte. In Tieren wurde jedoch kein äquivalenter Komplex identifiziert, und diese Frage wird weiterhin intensiv untersucht.
Verifizierung der Kinetochor-MT-VerankerungBearbeiten
Während der S-Phase verdoppelt die Zelle die gesamte in den Chromosomen gespeicherte genetische Information in dem Prozess, der als DNA-Replikation bezeichnet wird. Am Ende dieses Prozesses enthält jedes Chromosom zwei Schwesterchromatiden, das sind zwei vollständige und identische DNA-Moleküle. Beide Chromatiden bleiben bis zur Anaphase, in der die Chromosomentrennung stattfindet, durch Kohäsin-Komplexe verbunden. Wenn die Chromosomensegregation korrekt abläuft, erhält jede Tochterzelle einen vollständigen Chromatidensatz. Damit dies geschehen kann, muss sich jedes Schwesterchromatid (über den entsprechenden Kinetochor) an MTs verankern, die an entgegengesetzten Polen der mitotischen Spindel gebildet werden. Diese Konfiguration wird als amphitelisch oder bi-orientiert bezeichnet.
Während des Verankerungsprozesses können jedoch auch einige falsche Konfigurationen auftreten:
- monotelisch: nur eine der Chromatiden ist an MTs verankert, der zweite Kinetochor ist nicht verankert; in dieser Situation gibt es keine centromerische Spannung, und der Spindel-Checkpoint wird aktiviert, was den Eintritt in die Anaphase verzögert und der Zelle Zeit gibt, den Fehler zu korrigieren. Wenn er nicht korrigiert wird, könnte das nicht verankerte Chromatid zufällig in einer der beiden Tochterzellen enden und Aneuploidie erzeugen: eine Tochterzelle hätte einen Überschuss an Chromosomen und der anderen würden einige Chromosomen fehlen.
- syntelisch: beide Chromatiden sind an MTs verankert, die vom selben Pol ausgehen; auch in dieser Situation entsteht keine centromerische Spannung, und der Spindel-Checkpoint wird aktiviert. Wenn er nicht korrigiert wird, enden beide Chromatiden in derselben Tochterzelle, was zu Aneuploidie führt.
- merotelisch: mindestens ein Chromatid ist gleichzeitig an MTs verankert, die von beiden Polen ausgehen. Diese Situation erzeugt eine zentromerische Spannung, weshalb der Spindel-Checkpoint nicht aktiviert wird. Wenn dies nicht korrigiert wird, verbleibt das an beide Pole gebundene Chromatid in der Anaphase als Lagging-Chromosom und wird schließlich in zwei Fragmente zerbrochen, die auf die Tochterzellen verteilt werden, wodurch Aneuploidie entsteht.
Beide, die monotelische und die syntelische Konfiguration, erzeugen keine centromerische Spannung und werden vom Spindel-Checkpoint erkannt. Im Gegensatz dazu wird die merotelische Konfiguration von diesem Kontrollmechanismus nicht erkannt. Die meisten dieser Fehler werden jedoch erkannt und korrigiert, bevor die Zelle in die Anaphase eintritt. Ein Schlüsselfaktor bei der Korrektur dieser Verankerungsfehler ist der chromosomale Passagierkomplex, zu dem das Kinaseprotein Aurora B, seine Ziel- und aktivierende Untereinheit INCENP und zwei weitere Untereinheiten, Survivin und Borealin/Dasra B, gehören (besprochen von Adams und Mitarbeitern 2001). Zellen, in denen die Funktion dieses Komplexes durch dominant-negative Mutanten, RNAi, Antikörper-Mikroinjektion oder durch den Einsatz selektiver Medikamente ausgeschaltet wurde, akkumulieren Fehler in der Chromosomenverankerung. Viele Studien haben gezeigt, dass Aurora B benötigt wird, um die fehlerhafte Kinetochor-MT-Verankerung zu destabilisieren, was die Bildung von amphitischen Verbindungen begünstigt. Das Aurora B-Homolog in der Hefe (Ipl1p) phosphoriliert einige Kinetochor-Proteine, wie das konstitutive Protein Ndc10p und Mitglieder der Ndc80- und Dam1-DASH-DDD-Komplexe. Die Phosphorylierung von Komponenten des Ndc80-Komplexes bewirkt eine Destabilisierung der kMT-Verankerung. Es wurde vorgeschlagen, dass die Lokalisation von Aurora B für seine Funktion wichtig ist: da es im inneren Bereich des Kinetochors (im zentromerischen Heterochromatin) lokalisiert ist, trennen sich die Schwesterkinetochore, wenn die zentromerische Spannung hergestellt ist, und Aurora B kann seine Substrate nicht erreichen, so dass die kMTs stabilisiert werden. Aurora B wird in verschiedenen Krebsarten häufig überexprimiert und ist derzeit ein Ziel für die Entwicklung von Krebsmedikamenten.
Aktivierung des Spindel-CheckpointsBearbeiten
Der Spindel-Checkpoint oder SAC (für spindle assembly checkpoint), auch bekannt als mitotischer Checkpoint, ist ein zellulärer Mechanismus, der für die Erkennung folgender Punkte verantwortlich ist:
- Korrekte Montage der mitotischen Spindel;
- Anheftung aller Chromosomen an die mitotische Spindel in einer bipolaren Weise;
- Kongression aller Chromosomen an der Metaphasenplatte.
Wenn nur ein Chromosom (aus welchem Grund auch immer) während der Kongression zurückbleibt, erzeugt die Spindel-Checkpoint-Maschinerie eine Verzögerung der Zellzyklus-Progression: Die Zelle wird arretiert, was den Reparaturmechanismen Zeit gibt, das erkannte Problem zu lösen. Nach einiger Zeit, wenn das Problem nicht gelöst wurde, wird die Zelle der Apoptose (programmierter Zelltod) zugeführt, ein Sicherheitsmechanismus, um die Entstehung von Aneuploidie zu vermeiden, eine Situation, die im Allgemeinen dramatische Folgen für den Organismus hat.
Während strukturelle zentromerische Proteine (wie CENP-B) während der gesamten Mitose (auch während der Telophase) stabil lokalisiert bleiben, werden die Komponenten des Spindel-Checkpoints in Abwesenheit von Mikrotubuli in hohen Konzentrationen am Kinetochor zusammengebaut, und ihre Konzentrationen nehmen ab, wenn die Anzahl der am Kinetochor befestigten Mikrotubuli steigt.
In der Metaphase sinkt die Konzentration von CENP-E, Bub3 und Bub1 um das 3- bis 4-fache im Vergleich zu den Konzentrationen an ungebundenen Kinetochoren, während die Konzentration von Dynein/Dynactin, Mad1, Mad2 und BubR1 um das >10-100-fache abnimmt. In der Metaphase, wenn alle Chromosomen an der Metaphaseplatte ausgerichtet sind, werden also alle Checkpoint-Proteine vom Kinetochor freigesetzt. Das Verschwinden der Checkpoint-Proteine aus den Kinetochoren zeigt den Moment an, in dem das Chromosom die Metaphaseplatte erreicht hat und unter bipolarer Spannung steht. In diesem Moment setzen die Checkpoint-Proteine, die an Cdc20 binden und es hemmen (Mad1-Mad2 und BubR1), Cdc20 frei, das APC/CCdc20 bindet und aktiviert, und dieser Komplex löst die Trennung der Schwesterchromatiden und damit den Eintritt in die Anaphase aus.
Viele Studien weisen darauf hin, dass der Ndc80-Komplex an der Regulation der stabilen Assoziation von Mad1-Mad2 und Dynein mit den Kinetochoren beteiligt ist. Die Kinetochor-assoziierten Proteine CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H und BubR1 sind jedoch unabhängig von Ndc80/Hec1. Der verlängerte Arrest in der Prometaphase, der in Zellen mit niedrigen Ndc80/Hec1-Konzentrationen beobachtet wird, hängt von Mad2 ab, obwohl diese Zellen niedrige Konzentrationen von Mad1, Mad2 und Dynein an den Kinetochoren aufweisen (<10-15% im Verhältnis zu den ungebundenen Kinetochoren). Werden jedoch sowohl die Ndc80/Hec1- als auch die Nuf2-Spiegel reduziert, verschwinden Mad1 und Mad2 vollständig von den Kinetochoren und der Spindel-Checkpoint wird inaktiviert.
Shugoshin (Sgo1, MEI-S332 in Drosophila melanogaster) sind zentromerische Proteine, die essentiell sind, um das Kohäsin bis zur Anaphase an die Zentromere gebunden zu halten. Das menschliche Homolog, hsSgo1, assoziiert mit den Zentromeren während der Prophase und verschwindet mit Beginn der Anaphase. Wenn der Shugoshin-Spiegel durch RNAi in HeLa-Zellen reduziert wird, kann das Kohäsin während der Mitose nicht an den Zentromeren verbleiben, und folglich trennen sich die Schwesterchromatiden synchron, bevor die Anaphase beginnt, was einen langen mitotischen Arrest auslöst.
Auf der anderen Seite haben Dasso und Mitarbeiter herausgefunden, dass Proteine, die am Ran-Zyklus beteiligt sind, während der Mitose an Kinetochoren nachgewiesen werden können: RanGAP1 (ein GTPase-aktivierendes Protein, das die Umwandlung von Ran-GTP in Ran-GDP stimuliert) und das Ran-bindende Protein namens RanBP2/Nup358. Während der Interphase befinden sich diese Proteine an den Kernporen und nehmen am nukleo-cytoplasmatischen Transport teil. Die Kinetochore-Lokalisation dieser Proteine scheint funktionell bedeutsam zu sein, denn einige Behandlungen, die den Ran-GTP-Spiegel erhöhen, hemmen die Kinetochore-Freisetzung von Bub1, Bub3, Mad2 und CENP-E.
Orc2 (ein Protein, das zum Origin Recognition Complex -ORC- gehört, der an der DNA-Replikationsinitiation während der S-Phase beteiligt ist) ist auch in menschlichen Zellen während der Mitose an den Kinetochoren lokalisiert; in Übereinstimmung mit dieser Lokalisation deuten einige Studien darauf hin, dass Orc2 in Hefe an der Kohäsion der Schwesterchromatiden beteiligt ist, und wenn es aus der Zelle eliminiert wird, kommt es zur Aktivierung des Spindel-Checkpoints. Einige andere ORC-Komponenten (wie orc5 in S. pombe) sind ebenfalls an der Kohäsion beteiligt. Allerdings scheinen ORC-Proteine an einem molekularen Weg teilzunehmen, der additiv zum Kohäsin-Weg ist und weitgehend unbekannt ist.
Krafterzeugung zum Antrieb der ChromosomenbewegungBearbeiten
Die meisten Chromosomenbewegungen in Bezug auf die Spindelpole sind mit der Verlängerung und Verkürzung der kMTs verbunden. Eine der interessantesten Eigenschaften der Kinetochoren ist ihre Fähigkeit, den Zustand ihrer assoziierten kMTs (etwa 20) von einem Depolymerisationszustand an ihrem (+)-Ende in einen Polymerisationszustand zu verändern. Dies ermöglicht es den Kinetochoren von Zellen in der Prometaphase, eine „Richtungsinstabilität“ zu zeigen, indem sie zwischen anhaltenden Phasen der Bewegung in Richtung des Pols (polwärts) oder invers (anti-polwärts) wechseln, die mit abwechselnden Zuständen der kMTs Depolymerisation bzw. Polymerisation gekoppelt sind. Diese Bi-Stabilität der Kinetochore scheint Teil eines Mechanismus zu sein, um die Chromosomen am Äquator der Spindel auszurichten, ohne die mechanische Verbindung zwischen Kinetochoren und Spindelpolen zu verlieren. Es wird vermutet, dass die Bi-Stabilität der Kinetochore auf der dynamischen Instabilität des (+) Endes der Kinetochore beruht und teilweise durch die am Kinetochor vorhandene Spannung kontrolliert wird. In kultivierten Säugetierzellen fördert eine niedrige Spannung an den Kinetochoren die Veränderung in Richtung Depolymerisation der kMTs und eine hohe Spannung die Veränderung in Richtung Polymerisation der kMTs.
Kinetochore-Proteine und Proteine, die an das MTs (+)-Ende binden (kollektiv als +TIPs bezeichnet), regulieren die Kinetochore-Bewegung durch die Regulation der Dynamik des kMTs (+)-Endes. Allerdings ist die Kinetochor-Mikrotubuli-Schnittstelle hochdynamisch, und einige dieser Proteine scheinen bona fide Komponenten beider Strukturen zu sein. Zwei Gruppen von Proteinen scheinen besonders wichtig zu sein: Kinesine, die wie Depolymerasen arbeiten, wie z.B. KinI-Kinesine; und Proteine, die an MT (+)-Enden gebunden sind, +TIPs, die die Polymerisation fördern und damit vielleicht den Effekt der Depolymerasen antagonisieren.
- KinI-Kinesine werden „I“ genannt, weil sie eine interne Motor-Domäne aufweisen, die ATP verwendet, um die Depolymerisation des Tubulin-Polymers, des Mikrotubulus, zu fördern. In Wirbeltieren ist das wichtigste KinI-Kinesin, das die Dynamik der (+) Endmontage kontrolliert, MCAK. Es scheint jedoch, dass auch andere Kinesine involviert sind.
- Es gibt zwei Gruppen von +TIPs mit Kinetochore-Funktionen.
- Zur ersten gehören das Protein adenomatöse Polyposis coli (APC) und das assoziierte Protein EB1, die MTs benötigen, um sich auf den Kinetochoren zu lokalisieren. Beide Proteine sind für die korrekte Chromosomensegregation erforderlich. EB1 bindet nur an MTs im polymerisierenden Zustand, was darauf hindeutet, dass es die Stabilisierung der MTs während dieser Phase fördert.
- Die zweite Gruppe von +TIPs umfasst Proteine, die sich auch in Abwesenheit von MTs auf den Kinetochoren lokalisieren können. In dieser Gruppe gibt es zwei Proteine, die umfassend untersucht wurden: CLIP-170 und die mit ihm assoziierten Proteine CLASPs (CLIP-associated proteins). Die Rolle von CLIP-170 an den Kinetochoren ist unbekannt, aber die Expression einer dominant-negativen Mutante führt zu einer Verzögerung der Prometaphase, was darauf hindeutet, dass es eine aktive Rolle bei der Chromosomenausrichtung hat. CLASPs-Proteine sind für die Chromosomenausrichtung und die Aufrechterhaltung einer bipolaren Spindel in Drosophila, Mensch und Hefe erforderlich.