FilmEdit
Mastrantonio erschien erstmals auf der Leinwand in Brian De Palmas Scarface (1983) als Gina, die Schwester von Al Pacinos Tony Montana. Bekanntheit erlangte sie durch ihre Oscar- und Golden-Globe-nominierte Rolle in The Color of Money (1986) an der Seite von Paul Newman und Tom Cruise.
Zu ihren weiteren Rollen zählen Slam Dance (1987), an der Seite von Tom Hulce, und The January Man (1989) mit Kevin Kline. Außerdem spielte sie die Hauptrolle in dem Science-Fiction-Film The Abyss (1989) von Autor/Regisseur James Cameron mit Ed Harris. Sie spielte Maid Marian in dem Film Robin Hood: Prince of Thieves (1991) neben Kevin Costner. Sie spielte die Anwaltstochter von Gene Hackmans Charakter in Class Action, war Co-Star in dem Thriller Consenting Adults (1992) und spielte einen Fischerbootkapitän in The Perfect Storm (2000).
StageEdit
Mastrantonio trat am Broadway in verschiedenen Musicals auf, darunter West Side Story, Copperfield, The Human Comedy und die Wiederaufnahme von Man of La Mancha (2002), in der sie Aldonza/Dulcinea gegenüber Brian Stokes Mitchell spielte. Sie trat in den Produktionen des New York Shakespeare Festivals von Henry V, Measure for Measure und Twelfth Night auf. Ihre Bühnenauftritte in New York City brachten ihr eine Nominierung für den Tony Award und zwei Nominierungen für den Drama Desk Award ein.
Sie spielte auch die Hauptrolle in Grand Hotel im Donmar Warehouse im Londoner West End. 1984 war Mastrantonio in einer Benefiz-Aufführung von A Christmas Carol mit Helen Hayes, Raul Julia, Harold Scott, F. MacIntyre Dixon und Len Cariou im Symphony Space in New York zu sehen. Auf der Bühne war Mastrantonio zuletzt in A View from the Bridge als Beatrice neben Ken Stott und Allan Corduner am Duke of York’s Theatre in London zu sehen.
Fernsehen
Im Jahr 1991 trat Mastrantonio als Yelena in einer Inszenierung von Uncle Vanya in der britischen Anthologieserie Performance auf.
Sie hatte eine wiederkehrende Rolle während der Staffeln 4-5 (2005-2007) des Fernsehdramas Without a Trace.
Mastrantonio spielte den Einheitskommandanten Capt. Zoe Callas in Staffel 9 (2010) von Law & Order: Criminal Intent.
Ab der letzten Episode von Staffel 1 (2012) hatte Mastrantonio eine wiederkehrende Rolle in Grimm, in der sie Kelly Burkhardt, die Mutter des Protagonisten der Serie, spielte.
Im Jahr 2013 hatte sie einen Gastauftritt in Blue Bloods in der Episode „Inside Jobs“. Sie hatte eine wiederkehrende Rolle in der 2013-14 ausgestrahlten Sendung Hostages, in der sie die First Lady Mary Kincaid spielte.
Im Jahr 2015 wurde sie für eine Hauptrolle in Limitless auf CBS gecastet, in der sie die leitende FBI-Spezialagentin Nasreen „Naz“ Pouran spielte, die am 22. September 2015 Premiere hatte.
Im Jahr 2017 hatte sie eine Gastrolle als Marion James, stellvertretende Direktorin der Central Intelligence Agency, in drei Episoden von Marvel’s The Punisher auf Netflix.
Von 2018 bis 2020 spielte sie die Rolle der Madeline Burke in NBCs Action-Drama Blindspot.