METHODEN
Es handelt sich um eine Querschnittsstudie, die zur Bewertung des ABH-Sekretor- und Nicht-Sekretor-Status in der Bevölkerung von Karachi (Pakistan) durchgeführt wurde. Einhundertein gesunde erwachsene Studenten (76 männlich, 25 weiblich) im Alter von 15 bis 40 Jahren wurden zufällig für diese Studie ausgewählt. Von allen Personen wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Baqai Medical University, Karachi, genehmigt. Von allen Personen wurden zehn ml Speichel in sterilisierten Einweg-Plastikbehältern gesammelt. Fünf ml Blut (2 ml in einem EDTA-Röhrchen und 3 ml in einem nicht-antikoagulierten Röhrchen) wurden von allen Personen aseptisch für die Zell- und Serumgruppenbestimmung entnommen.
ABO- und Rh-Blutgruppenbestimmung:
Zubereitung einer 3%igen Erythrozytensuspension: Zwei ml Blut, das in einem EDTA-antikoagulierten Röhrchen abgenommen wurde, wurde bei niedriger Geschwindigkeit (1500 U/min) für 3 Minuten zentrifugiert. Das Plasma wurde in ein anderes Röhrchen überführt und für die Serumgruppenbildung verwendet. Das Röhrchen mit den Zellen wurde mit normaler Kochsalzlösung aufgefüllt. Das Röhrchen wurde gut gemischt und bei 1500 U/min für 3 Minuten erneut zentrifugiert. Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Beim letzten Waschvorgang wurde das Röhrchen 3 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit (3000 U/min) zentrifugiert und der Überstand verworfen. Ein transparenter Überstand und das Auftreten einer Zellschlepplinie zeigen an, dass die Zellen richtig gewaschen wurden.
I: Zellgruppierung: Drei saubere Glasröhrchen wurden als Röhrchen A für Anti A, Röhrchen B für Anti B und Röhrchen D für Anti D beschriftet. Ein Tropfen Antiserum wurde als Anti A-Serum in Röhrchen A, Anti B-Serum in Röhrchen B und Anti D-Serum in Röhrchen D gegeben. Ein Tropfen 3%ige Erythrozytensuspension wurde in Röhrchen A, Röhrchen B und Röhrchen D gegeben. Alle Inhalte wurden gut gemischt. Alle Röhrchen wurden sofort durch Auswuchten bei 3400 U/min für 15 Sekunden zentrifugiert. Alle Röhrchen wurden vorsichtig entnommen und die Röhrchen wurden einzeln auf Agglutination untersucht.
II: Serumgruppierung: Das Serum wurde nach 5-minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min von den nicht-antikoagulierten Röhrchen getrennt. Drei saubere Glasröhrchen wurden als Röhrchen „a“ für A-Zellen, Röhrchen „b“ für B-Zellen und „o“ für O-Zellen beschriftet. Jedem Röhrchen wurden zwei Tropfen Individualserum zugegeben. Ein Tropfen einer bekannten 3%igen Erythrozytensuspension von A-, B- und O-Zellen wurde in die Röhrchen „a“, „b“ und „o“ gegeben. Alle Röhrcheninhalte wurden gut gemischt und sofort für 15 Sekunden geschleudert. Alle Röhrchen wurden vorsichtig entnommen und einzeln auf Agglutination untersucht.
Alle Proben wurden innerhalb von 6 Stunden mit frischer Erythrozytensuspension derselben Person getestet. Sammlung und Verarbeitung von Speichel: Zehn ml Speichel wurde von allen Personen in einem sterilisierten Einweg-Plastikbehälter gesammelt und aus dem Behälter in ein sterilisiertes Einweg-Glasröhrchen überführt. Das Röhrchen mit dem Speichel wurde bei 2000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein anderes Glasröhrchen überführt. Das Röhrchen mit dem Speichelüberstand wurde zur Inaktivierung der Speichelamylase 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 56 °C gelegt. Das Probenröhrchen wurde abgekühlt und für 10 Minuten bei 2000 U/min rezentrifugiert. Der Überstand wurde in ein anderes Einweg-Reagenzglas überführt und für den Hämagglutinationshemmungs- oder Neutralisationstest verwendet.
Prinzip des Hämagglutinationshemmungstests: ABH-Substanzen, die in löslicher Form in Flüssigkeiten (z. B. Speichel) vorliegen, neutralisieren ihre entsprechenden Antikörper. Die Antikörper sind dann nicht mehr in der Lage, Erythrozyten, die die gleichen Antigene besitzen, zu agglutinieren.11,12
Durchführung des Hämagglutinationshemmungstests:
Zubereitung der Blutgruppen-Antiseren Verdopplungsverdünnungen: Zehn Reagenzgläser wurden in ein Gestell gestellt und entsprechend dem Titer beschriftet, d.h. 1:2 (Reagenzglas1), 1:4 (Reagenzglas 2), bis zu 1:1024 (Reagenzglas10). In alle Röhrchen wurden 200-µl-Salzlösung gegeben. Dem Röhrchen 1 wurden 200-µl Antiseren zugegeben und gut gemischt. Zweihundert µl der Verdünnung aus Röhrchen 1 wurden in Röhrchen 2 übertragen und gut gemischt. Der gleiche Vorgang wurde von Röhrchen 2 zu Röhrchen10 wiederholt. Zweihundert µl verdünntes Antisera wurde aus Röhrchen10 verworfen. Jedes Röhrchen enthielt die gleiche Menge an Antiseren und Kochsalzlösung. Diese Verdopplungsverdünnungslösung wurde für den Saumagglutinationshemmungstest verwendet.
Drei Reihen von 10 Reagenzgläsern wurden in ein Gestell gestellt und wie folgt beschriftet; I: Verdopplungsverdünnungsröhrchen (D/D-Röhrchen) II: Kontrollröhrchen (Titrationsröhrchen) III: Teströhrchen (Inhibitionsröhrchen).
In Reihe I wurde eine Verdopplungsverdünnung der gruppenspezifischen Antiseren hergestellt. Jedes Röhrchen wurde entsprechend dem Titer beschriftet, d.h. 1:2 (Röhrchen1), 1:4 (Röhrchen2) bis 1:1024 (Röhrchen10). Einhundert µl blutgruppenspezifische Antiseren jeder Verdünnung wurden in die entsprechend markierten Röhrchen in den Reihen II und III übertragen, wie in Tabelle I gezeigt. Einhundert µl Kochsalzlösung wurden in jedes Röhrchen in Reihe II gegeben. Hundert µl Speichel wurden in jedes Röhrchen in Reihe III gegeben. Alle Röhrchen der Reihen II und III wurden verschlossen und gut gemischt. Diese Röhrchen wurden bei 37°C für 30 Minuten im Wasserbad unter periodischem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 µl der 3%igen gruppenspezifischen Erythrozytensuspension in jedes Röhrchen der Reihen II und III gegeben und gut gemischt. Alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Alle Röhrchen wurden makroskopisch unter guter Lichtquelle auf Agglutination beobachtet.
Interpretation der Ergebnisse:
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Positiver Sekretorstatus:
Makroskopische Agglutination bei höherem Titer (1:128) in der Kontrolle (Reihe II) und niedrigerem Titer (1:16) im Test (Reihe III) zeigte das Vorhandensein von Blutgruppensubstanzen im Testspeichel an.
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Negativer Sekretorstatus:
Kein Unterschied im Titer, bei dem eine sichtbare Agglutination in beiden Reihen auftrat, deutete auf das Fehlen von blutgruppenspezifischen Substanzen im Speichel hin, die das Antiserum neutralisieren könnten.13
Statistische Analyse: Für die Datenanalyse wurde das Statistical Package for Social Sciences (SPSS) Version 17 verwendet. Die deskriptive Statistik wurde für die Berechnung von Häufigkeiten und Prozentsätzen verwendet.