(Bio)abbauwege von nitroaromatischen Sprengstoffen
TNT, das ein positives Θzz aufweist, unterliegt aufgrund des elektrophilen Charakters des aromatischen Kerns und des N-Atoms der Nitrogruppe hauptsächlich nukleophilen, reduktiven (Bio)transformationen (Stenuit und Agathos, 2010). Die C-, N- und H-Isotopenfraktionierung von nitroaromatischen Verbindungen in unterirdischen Materialien bestätigte, dass TNT hauptsächlich einer reduktiven Umwandlung unterliegt, während die Umwandlung von 2,4-DNT, das sich durch eine höhere Elektronendichte als TNT auszeichnet, hauptsächlich auf eine Oxygenierung zurückzuführen ist (Wijker et al., 2013).
TNT wird folglich durch drei aufeinanderfolgende Übertragungen eines Elektronenpaares leicht zu Nitroso-, Hydroxylamino- und schließlich zu aminoaromatischen Derivaten reduziert (Stenuit und Agathos, 2010). Der anfängliche Vier-Elektronen-Nitroreduktionsschritt wird durch typische NAD(P)H-abhängige sauerstoffunempfindliche (Typ I) Nitroreduktasen (Stenuit und Agathos, 2010) und Typ I und Typ II Hydridtransferasen der Old Yellow Enzyme (OYE) Familie katalysiert (van Dillewijn et al., 2008). Es wurde vermutet, dass weitere Enzyme am letzten Zwei-Elektronen-Nitroreduktionsschritt zur Bildung des Aminoarens beteiligt sein können (Riefler und Smets, 2002).
Außerdem unterliegt TNT nicht dem herkömmlichen elektrophilen Angriff durch Oxygenasen. Umgekehrt ist TNT anfällig für einen superoxidgetriebenen nukleophilen Angriff, wie dies bei dem biomimetischen System mit reduzierten Pyridinnukleotiden und Pyocyanin, einem redoxaktiven Metaboliten, der von Pseudomonas aeruginosa sezerniert wird, beobachtet wurde (Stenuit et al., 2009, Stenuit et al., 2012). Darüber hinaus werden anionische σ-Addukte von TNT, auch TNT-Meisenheimer-Komplexe genannt, leicht durch kovalente Bindungsbildung zwischen Nukleophilen, wie der negativ geladenen Form des Wasserstoffatoms, H- (Hydridion), und dem aromatischen Ring von TNT gebildet. Bisher wurden mehrere Enzyme aus Bakterien und Pflanzen charakterisiert, die die nukleophile Addition von Hydrid-Ionen an den aromatischen Ring von TNT katalysieren, einschließlich spezifischer NAD(P)H-abhängiger Typ II OYE-Hydrid-Transferasen (Abbildung 3(a)) (Beynon et al., 2009, Durchschein et al., 2013) und, in einem viel geringeren Ausmaß, spezifische F420-abhängige Actinomycetal-Hydridtransferasen (Heiss und Knackmuss, 2002). Nach der Übertragung von Hydrid-Ionen auf den aromatischen Ring von TNT werden Hydrid- und Dihydrid-Meisenheimer-Komplexe von TNT (-TNT bzw. -TNT) gebildet und können weiter Nitrit und diverse denitrierte Metaboliten von TNT ergeben, die sich typischerweise im Reaktionsmedium anreichern. Selbst wenn der Stickstoff aus TNT über die Aktivität der Nitritreduktase und den Glutaminsynthetase-Glutamat-Synthase (GS-GOGAT)-Weg weiter assimiliert werden kann, wurde daher häufig beobachtet, dass denitrierte Metaboliten von TNT nicht als Kohlenstoffquelle genutzt werden können. Das inhärente Problem der umfangreichen chemischen und metabolischen Fehlleitung schließt die Entstehung eines einzigartigen vorteilhaften biologischen Abbaupfades für TNT aus. Zum Beispiel können Kondensationsprodukte von TNT-Metaboliten zwischen (i) Nitroso- und Hydroxylamino-Dinitrotoluol-Isomeren zur Bildung von Tetranitroazoxytoluol-Verbindungen wie 4,4′,6,6′-Tetranitro-2,2′-Azoxytoluol und (ii) Hydroxylamino-Dinitrotoluol-Isomeren und protonierten Dihydrid-Meisenheimer-Komplexen von TNT zur Bildung von sekundären Diarylaminen gebildet werden (van Dillewijn et al., 2008). TNT-Metaboliten, die durch Reduktion der Nitrogruppe entstehen, können auch eine Oxidation der Methylgruppe oder eine Acetylierung der Aminogruppe durchlaufen (Stenuit und Agathos, 2010). Diese verschiedenen Verbindungen werden gemeinhin als Dead-End-Metaboliten bezeichnet, da sie akkumulieren. Darüber hinaus scheint die Bildung von Selbstmordmetaboliten aufgrund der toxischen Wirkungen von Zwischenprodukten und Sekundärprodukten, die bei der Reduktion von Nitroanteilen entstehen, ein großes Hindernis für einen produktiven Metabolismus von TNT zu sein (Lenke et al., 2000).
Abbildung 3. Biologischer Abbau von Nitrosprengstoffen katalysiert durch (a) einige Mitglieder der OYE-Familie (z.B., PETN-Reduktase), (b) die F420-abhängigen Reduktasen des npd-Clusters, und (c) das XplA-XplB-System.
Einige Autoren berichteten jedoch kürzlich über vorteilhafte TNT-Abbauwege mit (i) der Produktion der metabolisierbaren Verbindung 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) aus dem Monohydrid-Meisenheimer-Komplex von TNT (Stenuit und Agathos, 2010, Ziganshin et al, 2010a,b) und (ii) der Nachweis mittels Stable Isotope Probing (SIP) der Assimilation von 15 N und 13C aus TNT in bakterielle DNA (Gallagher et al, 2010).
Unter Ausnutzung der katabolen Fähigkeiten der Hefen Yarrowia lipolytica und Geotrichum candidum und der Ansäuerung des Kulturmediums durch die Produktion von organischen Säuren berichteten Ziganshin et al. (2010a,b) über die Transformation unter sauren Bedingungen (d. h., bei einem pH < 4,2) von C3–TNT zu 2,4-DNT, einem mineralisierbaren TNT-denitrierten Metaboliten (Johnson et al, 2002), mit gleichzeitiger Freisetzung von Nitrit.
Gallagher et al. (2010) berichteten unter Verwendung von DNA-SIP und T-RFLP über die Verwertung von TNT als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle unter sulfogenen Bedingungen durch einen Lysobacter taiwanensis-Stamm, der ursprünglich in anaeroben organikreichen estuarinen Sedimenten vorkam. Der Einbau von TNT in die Lysobacter-Zellbiomasse, entweder als primäres Substrat oder als Co-Substrat (Kometabolismus), muss jedoch noch aufgeklärt werden. Auch wenn weitere Experimente in axenischen Kulturen notwendig sind, um die vollständigen, von L. taiwanensis katalysierten Abbauwege zu entschlüsseln, bietet der eindeutige Nachweis der anaeroben bakteriellen Assimilation von N und C aus TNT neue vielversprechende Sanierungsmöglichkeiten, wie z.B. Versuche zur Bioaugmentation von anaerobem TNT-kontaminierten Umgebungen.
Obwohl die in der Literatur berichteten Wege des biologischen Abbaus von TNT ausschließlich durch Kometabolismus unterstützt werden, wurde von bestimmten Bakterien der Ordnung Actinomycetales berichtet, die TNP als einzige Stickstoff-, Kohlenstoff- und Energiequelle ohne Reduktion des Nitroanteils nutzen (z. B., Picraminsäure, ein Monoamino-Derivat von TNP) (Hofmann et al., 2004). Der wichtigste TNP-Abbauweg ist der enzymatische Hydrid-Transfer zum aromatischen Kern, gefolgt von sukzessiven Denitrierungsreaktionen und der Einschleusung der abgespaltenen Metaboliten in den Tricarbonsäurezyklus (TCA). Der TNP-Abbau-Gencluster (npd-Cluster) wurde charakterisiert, wobei verschiedene Induktoren und der Transkriptionsregulator NpdR identifiziert wurden (Nga et al., 2004). Die Enzyme, die an den peripheren katabolen Wegen von TNP in Rhodococcus opacus HL PM-1 beteiligt sind, sind die Hydridtransferase II (HTII), kodiert von npdI, und die Hydridtransferase I (HTI), kodiert von npdC, die den Monohydrid-Meisenheimer-Komplex von TNP (-TNP) bzw. den Dihydrid-Meisenheimer-Komplex von TNP (-TNP) produzieren (Nga et al., 2004). Die Aktivität von HTII und HTI ist abhängig von einer NADPH-abhängigen F420-Reduktase (NdfR), die von npdG kodiert wird und als Elektronen-Shuttle zwischen NADPH und F420 fungiert. Wie in Abbildung 3(b) dargestellt, wird der Transfer des Hydrids vom reduzierten Coenzym F420H2 auf den aromatischen Ring von TNP durch HTII/HTI katalysiert (Nga et al., 2004). In Nocardioides simplex FJ2-1A läuft derselbe periphere katabole Weg von TNP ab, außer dass eine einzigartige Hydridtransferase (HT) die Produktion von -TNP und -TNP katalysiert (Hofmann et al., 2004). Anschließend katalysiert die Tautomerase NpdH, kodiert durch npdH, einen Protonen-Shift-Tautomerismus von -TNP, um die Nitroform (R2C(- H)NO2) und die Aci-Nitroform (R2C=N+(- O-)OH) im Gleichgewicht herzustellen. Letztere durchläuft eine enzymatische Denitrierungsreaktion, katalysiert durch zellfreie Extrakte von R. opacus HL PM-1 oder N. simplex FJ2-1A (enthaltend eine Orphan-Denitrase), zur Bildung des Monohydrid-Meisenheimer-Komplexes von 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) (Hofmann et al., 2004). Nach einer zweiten Hydrierung durch das HTI-NdfR (bzw. HT-NdfR) System wird das Dihydrid-Zwischenprodukt bei pH 7,5 zu 2,4-Dinitrocyclohexanon protoniert, das eine Hydrolase-katalysierte Spaltung zu 4,6-Dinitrohexanoat erfährt. Da letzteres schließlich dem TCA-Zyklus zugeführt werden kann, ist der biologische Abbau von TNP selbsterhaltend und kann an Standorten mit hohen TNP-Konzentrationen den abbauenden Mikroorganismen selektive Vorteile verschaffen.
Für den biologischen Abbau des TNT-Analogons Tetryl ist bekannt, dass durch seine Hydrolyse TNP entstehen kann, das vollständig mikrobiell abgebaut werden kann (Lewis et al., 2004). Die enzymatische N-Denitrierung von Tetryl unter anaeroben Bedingungen wurde auch unter Bildung von N-Methyl-2,4,6-trinitroanilin beobachtet (Myers und Spinnato, 2007), einer trinitroaromatischen Verbindung, für die Experimente zur biologischen Abbaubarkeit durchgeführt werden müssen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass keine einzelne Mikrobe genügend Reaktionen durchführt, um einen Nutzen aus dem biologischen Abbau von TNT zu ziehen (Copley, 2009). Die Entstehung eines Mineralisierungsweges kann schneller erfolgen, wenn mehrere aufeinanderfolgende Reaktionen innerhalb einer einzigen Mikrobe zu finden sind. Obwohl eine Dioxygenase-katalysierte Eliminierung von Nitrit als Initialreaktion für 2,6-DNP berichtet wurde (Ecker et al., 1992), ist ein elektrophiler Angriff von 2,4-DNP aufgrund des negativen induktiven Effekts der Hydroxylgruppe und der spezifischen sterischen Hinderung bisher nicht beschrieben worden. Daher wird für 2,4-DNP und TNP üblicherweise eine initiale Hydrierung des aromatischen Ringsystems beobachtet, so dass ihr biologischer Abbau durch die gleiche enzymatische Maschinerie in einer einzigen Mikrobe katalysiert wird. Umgekehrt wurden für TNT- und DNT-Isomere unterschiedliche biologische Abbaupfade beobachtet. Tatsächlich werden 2,4-DNT und 2,6-DNT vollständig über eine initiale Dioxygenase-Reaktion abgebaut (Johnson et al., 2002). Folglich wurden syntrophe Prozesse, z. B. reduktive Denitrierung von TNT zu 2,4-DNT, gefolgt von oxidativer Biotransformation von 2,4-DNT, als geeignete Strategie zur TNT-Mineralisierung vorgeschlagen (Tront und Hughes, 2005). Allerdings treten während der TNT-Denitration sowohl in Rein- als auch in Mischkulturen mehrere konkurrierende Pfade auf, die in der Folge eher zu denitrierten Metaboliten als zu DNT-Isomeren führen. In diesem Zusammenhang kann der experimentelle Nachweis der Produktion von 2,4-DNT aus dem durch Hefestämme katalysierten TNT-Abbau (Ziganshin et al., 2010a,b) von primärer Bedeutung sein, um einen mineralisierungsgetriebenen Prozess von TNT zu implementieren.