RESEARCH DESIGN AND METHODS
Noninvasive glucose monitor technology
La tecnologia utilizzata per il dispositivo di misurazione del glucosio è basata sul principio che il corpo umano emette naturalmente una forte radiazione elettromagnetica nella regione di lunghezza d’onda micrometrica e sulla scoperta che tale radiazione contiene informazioni spettrali degli analiti dei tessuti. Anche se questa tecnologia brevettata ha applicazioni per misurare i livelli di varie sostanze nel corpo umano, il piano iniziale è quello di utilizzarla in un monitor BG a causa del significativo bisogno insoddisfatto di sostituire gli attuali metodi di misurazione.
Il corpo umano emette una forte radiazione elettromagnetica. Le leggi della fisica affermano che tutti gli oggetti emettono radiazioni IR e che l’intensità della radiazione e le caratteristiche spettrali dell’oggetto sono determinate dalla sua temperatura assoluta così come dalle proprietà e dagli stati dell’oggetto.
La legge di Planck (19) descrive una relazione tra l’intensità radiante, la distribuzione spettrale e la temperatura del corpo nero. Il corpo umano è un eccellente emettitore di corpo nero di luce IR media esattamente nella giusta regione spettrale. La caratteristica spettrale dell’emissione termica è influenzata dalla composizione del tessuto dell’individuo e dalle concentrazioni degli analiti. La legge di Kirchhoff conferma che per l’intero corpo alla stessa temperatura e per la stessa lunghezza d’onda, l’assorbibilità è uguale all’emissività monocromatica.
I sensori per la misurazione degli analiti devono avere la sensibilità e la selettività richieste, la sterilizzabilità e la stabilità a lungo termine. I sensori spettroscopici possono soddisfare tutti questi requisiti. Tra le varie regioni spettrali, la spettroscopia nel medio infrarosso offre una maggiore sensibilità e selettività a causa del contenuto informativo della regione dell’impronta digitale. La selettività di questa tecnologia si basa sullo stesso principio della selettività del metodo della spettroscopia di assorbimento per la misurazione degli analiti. Il glucosio ha caratteristiche spettrali molto ben definite nella regione IR dell’impronta digitale, come mostrato (per esempio, negli studi di Heise et al. e Vonach et al. e nei nostri spettri di emissione termica al plasma Fig. 2).
In una semplice disposizione sperimentale, si può dimostrare che l’emissione dal glucosio può essere rilevata utilizzando rivelatori a temperatura ambiente in una configurazione basata su filtri. Uno spettrometro a filtro non dispersivo appositamente progettato (Fig. 1) ha eseguito misure di assorbimento ed emissione. Uno spettrometro a filtro ha il vantaggio della semplicità, un alto rapporto segnale-rumore, alta produttività e basso costo. Le ruote dei filtri ruotabili con curve di trasmissione caratteristiche, quando posizionate nel percorso della luce, generano bande di passaggio variabili con bassa risoluzione. Come filtro, abbiamo usato un filtro IR variabile circolare, segmento #3, realizzato dall’Optical Coating Laboratory, con una banda di trasmissione da 7,7 a 14,1 μm. La radiazione IR è stata raccolta da una guida d’onda IR fatta da un tubo, con una superficie interna dorata, che ha diretto la radiazione IR in un filtro variabile molto vicino. Dall’altro lato del filtro, un rivelatore a termopila (Perkin Elmer/Heineman modello TPS 434) è stato posto sull’asse ottico della guida d’onda molto vicino alla superficie del filtro. La combinazione del diametro della guida d’onda, il foro di apertura del rivelatore e la dimensione della sua area sensibile hanno funzionato come una fenditura nella spettrometria standard con < risoluzione spettrale di 0,2μm. Informazioni utili sui dati spettrali sono state trovate nell’intervallo di 9-13 μm, grazie alla combinazione dell’effetto bordo alle estremità del filtro e della risoluzione dovuta alla larghezza della fenditura. Almeno sei spettri sono stati mediati, e la procedura di lisciatura di Fourier a sei punti è stata utilizzata per rimuovere il rumore veloce dallo spettro. Sia la trasmissione che gli spettri di emissione (dopo la correzione per l’emissione termica di fondo dello strumento) sono stati divisi per i valori di intensità di radiazione teorica di corpo nero, ottenendo valori proporzionali all’assorbibilità e all’emissività monocromatica. I cambiamenti misurati in emissività monocromatica erano nell’intervallo di 10-4, ancora al di sopra del limite di rumore del sistema. Come esempio, la Fig. 2A mostra gli spettri di emissione termica IR (a 41°C) (curva superiore) del glucosio in una tavoletta KBr (bromuro di potassio) con uno spettro di trasmittanza (curva inferiore) per confronto. Anche con questi spettri di scarsa qualità, si possono osservare le corrispondenti bande di assorbimento del glucosio, per esempio, una banda principale a 9,6 μm, una banda a 10,9 μm (corrispondente allo stato vibrazionale 914 cm-1 del glucosio), e una banda più debole intorno ai 12 μm. Si può notare una tipica immagine speculare tra gli spettri di trasmissione e di emissione. Lo spettro IR del glucosio puro evidenzia le bande spettrali fondamentali della firma del glucosio.
Sono state misurate le caratteristiche di emissione IR termica di diverse concentrazioni di glucosio in soluzioni di acqua e plasma umano. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che tali misure sono state riportate. I risultati per l’emissione IR del plasma umano a 37°C sono mostrati in Fig. 2B. Questa figura sottolinea due caratteristiche importanti: in primo luogo, mostra la regione spettrale di interesse e, in secondo luogo, presenta la prova sperimentale della capacità di rilevamento dell’emissione termica degli attuali rivelatori IR a temperatura ambiente. La deconvoluzione mostra le bande sensibili e non sensibili ai cambiamenti di concentrazione del glucosio nel plasma umano. Per chiarezza di visualizzazione, gli spettri sono spostati verso l’alto lungo l’asse verticale. I risultati della deconvoluzione nella tabella inserita mostrano i cambiamenti di intensità dei picchi rispetto alla concentrazione di glucosio. Ancora una volta, si possono osservare nell’emissione le bande corrispondenti di assorbimento del glucosio, per esempio, una banda principale a 9,8 μm, una banda a 10,9 μm (corrispondente allo stato vibrazionale 914 cm-1 del glucosio), e una banda più debole intorno a 11,9 μm.
La radiazione termica dal corpo umano contiene informazioni sulle caratteristiche spettrali dell’oggetto ed è determinata dalla temperatura assoluta del corpo così come dalle proprietà e dagli stati dei tessuti del corpo emittente. Così, si può concludere che le caratteristiche spettrali del sangue con diversi contenuti di glucosio (o altri analiti) cambieranno l’emissività della membrana timpanica e renderanno possibile misurare la concentrazione di glucosio nel sangue.
La membrana timpanica è nota per essere in una posizione eccellente per misurare la temperatura corporea perché condivide la sua fornitura di sangue con l’ipotalamo, il centro di regolazione della temperatura del corpo centrale. Un termometro timpanico misura l’intensità integrale (su tutte le lunghezze d’onda) della radiazione termica IR. Un sensore inserito nel canale uditivo può ottenere una visione chiara della membrana e dei suoi vasi sanguigni per misurare la quantità di radiazione IR che la membrana emette. Rispetto alla radiazione teorica del corpo nero descritta dalle leggi di Planck e Kirchhoff, questa radiazione IR è modificata spettralmente dalla composizione del tessuto. Così, la radiazione IR ha caratteristiche spettrali, per esempio, del sangue nella membrana timpanica.
In questo strumento, le caratteristiche spettrali di vari costituenti del sangue sono stati separati utilizzando metodi di spettroscopia chimica analitica. Lo strumento si basa sull’uso di filtri IR posti davanti alle finestre del rivelatore IR. Un filtro passa la radiazione attraverso le bande di emissione termica con le firme del glucosio ed è posto in una delle finestre del rivelatore IR, mentre l’altra finestra del rivelatore IR è coperta da un filtro capace di passare la radiazione che non include le bande di emissione caratteristiche dell’analita a lunghezze d’onda nella gamma di interesse. Un confronto dell’intensità della radiazione tra le due finestre del rivelatore (come mostrato in Fig. 3) fornisce una misura che è proporzionale alla concentrazione dell’analita e può essere correlata alla concentrazione di BG.
La Figura 3 mostra uno schema semplificato dello strumento. Lo strumento riceve otticamente la radiazione IR dal bersaglio dell’oggetto, come una membrana timpanica. Il sistema di rilevamento consiste in un set di filtri IR ottici e un rilevatore a termopila sensibile nella regione IR della radiazione del corpo umano. Uno degli elementi di rilevamento è coperto da un filtro IR sensibile alla firma IR del glucosio, mentre un filtro appropriato che non ha bande spettrali caratteristiche dell’analita misurato copre l’altra area di rilevamento. Nel nostro prototipo è stato utilizzato un cosiddetto punto quasi-isosbico a circa 8,5 μm per le misure di intensità di emissione di riferimento e 9,6 μm per le misure della firma del glucosio. La radiazione IR spettralmente modificata dalla membrana timpanica illumina entrambe le finestre. La differenza dell’intensità della radiazione tra i due percorsi di radiazione fornisce una misura proporzionale alla concentrazione dell’analita.
Disegni dello studio clinico
La University of Connecticut Institutional Review Board ha approvato lo studio e tutti i soggetti hanno dato il consenso informato scritto prima di partecipare. Un totale di 5 donne e 26 uomini con diabete insulino-richiedente, di età compresa tra 18 e 75 anni, sono stati arruolati. Due soggetti arruolati sono stati esclusi dal test. Uno aveva un cattivo accesso venoso e l’altro aveva una concentrazione di glucosio nel siero >400 mg/dl all’inizio dello studio e richiedeva un trattamento medico. Le misure di glucosio appaiate dei primi 23 soggetti sono state utilizzate per calibrare la misura non invasiva del monitor della concentrazione di glucosio della membrana timpanica con la concentrazione di glucosio nel siero da una vena antecubitale. Questa calibrazione è stata successivamente testata confrontando le concentrazioni di glucosio della membrana timpanica con le concentrazioni di glucosio nel siero in sei soggetti.
La mattina dello studio, i soggetti hanno continuato i loro farmaci abituali ma non hanno preso l’insulina o fatto colazione. Il condotto uditivo di ogni soggetto è stato esaminato per verificare che la membrana timpanica fosse libera da cerume. In quattro soggetti, l’irrigazione con acqua calda è stata utilizzata per rimuovere il cerume che occludeva la membrana timpanica. Una linea endovenosa è stata posta in una vena antecubitale e mantenuta aperta con soluzione fisiologica allo 0,45%. A 0 min e ogni 10 min per un totale di 210-250 min, sono stati prelevati 3 ml di sangue per la misurazione della concentrazione di glucosio nel siero. Una misurazione della concentrazione di glucosio della membrana timpanica è stata effettuata immediatamente dopo il completamento della flebotomia. L’insulina a lunga durata d’azione abituale del soggetto è stata somministrata a 0 min, una colazione con dieta a base di carboidrati è stata somministrata a 30 min, e il bolo di insulina abituale del paziente è stato consegnato a 90 min. Per i soggetti che non utilizzano normalmente un bolo di insulina, il bolo è stato determinato dal medico supervisore nel tentativo di normalizzare la concentrazione di glucosio nel siero entro la fine dello studio. Il medico supervisore era a conoscenza dei risultati delle misurazioni del glucosio nel siero e faceva interventi clinicamente appropriati per concentrazioni di glucosio nel siero >400 mg/dl o <60 mg/dl. La temperatura ambiente è stata mantenuta tra i 18 e i 25°C. La temperatura orale del soggetto, la temperatura della stanza e l’umidità della stanza sono state registrate a 0 minuti e ogni 30 minuti fino alla fine dello studio. La gamma di umidità relativa della stanza durante gli esperimenti era tra il 20 e il 60%. Le misurazioni della temperatura dell’orecchio IR sono state effettuate 2 minuti dopo ogni misurazione del glucosio. L’infermiera che effettuava le misurazioni era cieca alle concentrazioni di glucosio sierico della membrana timpanica.
Un totale di 432 punti di dati appaiati da 20 soggetti sono stati utilizzati per la calibrazione della concentrazione di glucosio della membrana timpanica con la concentrazione di glucosio sierico. Un infermiere addestrato ha effettuato le misurazioni della concentrazione di glucosio della membrana timpanica per 19 di questi soggetti. Quattro soggetti sono stati addestrati ed hanno eseguito le misurazioni della concentrazione di glucosio della membrana timpanica su se stessi. Due monitor erano disponibili per l’uso. Nella modalità di calibrazione, il monitor principale è stato utilizzato per 16 soggetti. Il monitor di riserva è stato utilizzato per quattro soggetti.
I risultati di tre soggetti non sono stati inclusi nell’analisi di calibrazione. I risultati di un soggetto che ha eseguito le proprie misurazioni e quelli di altri due soggetti (con misurazioni eseguite da un’infermiera) sono stati respinti perché le letture non soddisfacevano i criteri stabiliti per l’accettabilità dei dati degli strumenti non invasivi (vedi metodi di analisi dei dati). Il monitor primario è stato utilizzato per questi tre soggetti. Dopo la calibrazione del dispositivo non invasivo, il protocollo dello studio è stato eseguito in modo prospettico cieco su sei soggetti, tutti utilizzando il monitor primario. L’osservatore che riportava la concentrazione di glucosio sulla membrana timpanica e l’osservatore che riceveva il rapporto della concentrazione di glucosio nel siero erano ciechi ai risultati della misurazione complementare. Tutti i punti di dati riportati sono stati inclusi nell’analisi dei dati dei sei soggetti studiati prospetticamente.
Metodi di analisi dei dati
Gli studi del monitor non invasivo del glucosio sono stati divisi in due parti. Nella prima parte, il monitor è stato calibrato utilizzando un modello di regressione non lineare con i dati del primo gruppo di soggetti. Nella seconda parte, sono stati eseguiti gli studi prospettici per la convalida della calibrazione e del metodo utilizzato.
Nella prima parte dell’esperimento, l’osservatore che riportava la concentrazione di glucosio sulla membrana timpanica aveva accesso sia alle misurazioni invasive che a quelle non invasive. I dati di 23 soggetti (511 punti di dati appaiati) sono stati raccolti per la calibrazione del monitor. Durante l’analisi dei dati di calibrazione, è stato riscontrato che per tre soggetti, >il 50% delle misurazioni (22-25 misurazioni sono state effettuate su un singolo soggetto) presentava un errore dello strumento rispetto a nessuno o a meno di qualche errore per gli altri soggetti. L’errore dello strumento era indicato se un segnale dal rilevatore del monitor non era regolare (il valore interno di un segnale dal rilevatore cambia >20% per alcuni dei 60 punti di dati successivi misurati per singolo inserimento del monitor nel canale uditivo del soggetto) o il segnale del rilevatore era fuori dalla gamma come definito nella dipendenza della temperatura ambiente e dell’umidità della stanza. Il gruppo di errori per questi tre soggetti ha suggerito un errore fondamentale dovuto alla procedura medica (ad esempio, potenziale interferenza spettrale di altri analiti che richiederà studi appositamente progettati o un canale uditivo non dritto o ben raddrizzato) o di misurazione (il canale uditivo non è stato sigillato correttamente dalla punta di misurazione dello strumento, la punta di misurazione non è stata posizionata lungo il canale uditivo e l’asse della membrana timpanica, o un errore di tecnica dell’operatore si è verificato nella gestione delle misurazioni). Questi tre soggetti sono stati eliminati come dati di ingresso per la calibrazione. Per la calibrazione finale, sono stati utilizzati 20 soggetti (per un totale di 432 punti di dati appaiati senza errori dello strumento), con un errore dello strumento indicato per 13 punti di dati (2,9% di 445 punti totali). Sulla base dei risultati della calibrazione, l’analisi della potenza dei dati di cui sopra è stata eseguita da uno statistico dell’University of Connecticut Health Center, che ha indicato che sono necessari da quattro a sei soggetti per produrre una modalità predittiva delle misure per la convalida della calibrazione per il monitor non invasivo del glucosio.
Nella seconda parte dell’esperimento, sono state eseguite misure completamente predittive. L’osservatore che riportava la concentrazione di glucosio sulla membrana timpanica era cieco ai risultati delle concentrazioni di glucosio nel siero di laboratorio. Le stime con metodi invasivi e non invasivi sono state effettuate in modo indipendente. Per i sei soggetti, lo strumento ha indicato quattro errori di misurazione (3,1% su un totale di 130 punti dati appaiati). Una volta effettuata e riportata una stima, nessun punto è stato scartato. Questa seconda parte mirava a dimostrare la riproducibilità della metodologia una volta stabilita la calibrazione del monitor del glucosio.
Un’analisi statistica finale dei risultati degli studi sul monitor BG non invasivo è stata fatta utilizzando un metodo di errore nelle variabili (chiamato anche “regressione ortogonale”). La regressione ordinaria dei minimi quadrati presuppone che solo le misurazioni delle coordinate y siano associate a errori di misurazione casuali. È spesso il caso che le incertezze nei dati risiedano in entrambe le coordinate x e y. Questo è il caso in cui sia x che y sono quantità osservate e quindi sono note per avere errori. Il modello error-in-variables prende in considerazione gli errori di misura per entrambi gli insiemi di misure. Tali modelli includono Deming (20), il metodo di Passing e Bablok (21), e la regressione ortogonale. Il metodo di Deming richiede la specificazione del rapporto tra le DS al quadrato per due quantità osservate, ma non permette di usare diverse DS nell’intervallo delle quantità misurate x o y. La maggior parte delle procedure di regressione ortogonale distribuisce equamente l’errore sulle coordinate x e y. In questa analisi di studi di monitor non invasivi, è stato utilizzato il metodo di regressione ortogonale basato su un algoritmo descritto da Reilly et al. (22). Il suddetto modello permette di introdurre l’errore di misurazione per entrambi gli assi su tutta la gamma delle quantità misurate.
Misurazioni di laboratorio del glucosio sierico
La concentrazione di glucosio sierico di laboratorio è stata determinata con il metodo del tasso di consumo di ossigeno utilizzando un elettrodo di ossigeno (Synchron LX20 Instrument; Beckman Instruments, Brea, CA). Le SD delle misurazioni di laboratorio fornite dal Clinical Laboratory dell’University of Connecticut Health Center sono le seguenti: per il livello di controllo qualità 1 (QC1) con una BG media di 61 mg/dl, SD = ±2 mg/dl; per QC2 con una BG media di 120 mg/dl, SD = ±4 mg/dl; e per QC3 con una BG media di 373 mg/dl, SD = ±11 mg/dl. L’errore relativo sull’intera gamma di concentrazioni di glucosio era di circa ±3,3%.