II Panoramica della morfologia e degli eventi molecolari dell’apoptosi
La morte cellulare apoptotica può essere divisa in quattro fasi sequenziali: inizio, decisione di morire, esecuzione e ingestione. Una serie di stress cellulari può avviare l’apoptosi attraverso l’attivazione di vie di segnalazione intracellulari o il rilascio di secondi messaggeri. Alcuni esempi di trigger di morte cellulare sono le radiazioni ionizzanti, i farmaci chemioterapici, l’ipertermia e la privazione del fattore di crescita. Molecole presentate da altre cellule, come il ligando Fas (FasL) e il fattore di necrosi tumorale (TNF), possono anche indurre l’apoptosi nelle cellule che hanno i recettori appropriati. Una cellula può ricevere una varietà di segnali simultaneamente, compresi i segnali di proliferazione e di morte cellulare. In risposta a questi segnali, una cellula deve valutare la sua situazione e decidere se suicidarsi per apoptosi. Le molecole regolatrici chiave in questa fase sono i membri della famiglia delle proteine Bcl-2 (White, 1996; Yang e Korsmeyer, 1996), anche se il meccanismo della loro azione non è completamente compreso. Una volta che una cellula ha preso la decisione di morire, vengono attivate le molecole che agiscono come carnefici. In tutti i tipi di apoptosi studiati, in una varietà di organismi multicellulari, i boia includono proteasi citosoliche, la maggior parte delle quali appartengono a una famiglia chiamata caspasi (Nicholson e Thornberry, 1997; Alnemri, 1997). Queste proteasi attaccano specifiche proteine cellulari con conseguente distruzione irreversibile di processi e strutture cellulari critiche. Nella fase finale dell’apoptosi, i resti della cellula morente sono riconosciuti, inghiottiti e degradati, o da una cellula vicina o da un macrofago spazzino.
I cambiamenti morfologici associati all’apoptosi sono distinti e ben caratterizzati (Wyllie, 1987; Darzynkiewicz et al., 1997). Le cellule sottoposte ad apoptosi si restringono rapidamente e si condensano, allontanandosi dalle cellule vicine. Come risultato della perdita di volume citoplasmatico, la membrana plasmatica forma macchie e sporgenze, dando alla cellula un aspetto a bolle. Si osserva anche un rapido aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio (Schwartzman e Cidlowski, 1993). La membrana nucleare si arrotonda e la cromatina si condensa e si aggrega in forme dense e a mezzaluna vicino alla membrana nucleare. La condensazione della cromatina è associata alla scissione del DNA a doppio filamento da parte di una o più endonucleasi nucleari (Wyllie et al., Montague e Cidlowski, 1996) e alla degradazione della lamina nucleare da parte delle proteasi (Lazebnik et al., 1995).
La degradazione del DNA durante l’apoptosi avviene secondo uno schema preciso e riproducibile (Wyllie et al., 1992; Montague e Cidlowski, 1996). Inizialmente, il DNA cromosomico viene scisso in grandi segmenti di circa 50-300 kilobasi (Oberhammer et al., 1993). Nella maggior parte, ma non in tutti i casi di apoptosi, questi domini sono poi ulteriormente digeriti in frammenti più piccoli per scissione tra nucleosomi. La separazione del DNA dai nuclei apoptotici mediante elettroforesi su gel di agarosio produce un modello caratteristico di questi frammenti mono- o oligonucleosomici in multipli di 185-200 paia di basi (bp), descritto come una scala di DNA (Tilly e Hsueh, 1993). Le endonucleasi responsabili di questa frammentazione del DNA non sono state identificate in modo convincente, sebbene siano stati suggeriti diversi candidati (Montague e Cidlowski, 1996). Alcuni studi hanno suggerito un ruolo per la DNasi I o II, ma questi enzimi non sono normalmente localizzati nel nucleo. Forse un candidato migliore è un’endonucleasi 18 kD Ca2 +/Mg2 +-dipendente chiamata NUC18 che è stata isolata da estratti nucleari apoptotici e trovata altamente omologa alla ciclofilina A. NUC18 può essere responsabile della scissione del DNA in frammenti di 50 kD. Inoltre, è stata identificata una nuova endonucleasi 95 kD Ca2 +/Mg2 +-dipendente che è attiva durante l’apoptosi (Pandey et al., 1997). Una proteina chiamata fattore di frammentazione del DNA (DFF) che sembra attivare l’endonucleasi apoptotica è stata anche isolata da cellule HeLa (Liu et al., 1997).
I cambiamenti nei mitocondri delle cellule apoptotiche precedono la condensazione cellulare e la disintegrazione nucleare e possono essere un evento iniziale essenziale nell’apoptosi (Petit et al., 1996; Kroemer, 1997). I mitocondri mostrano una depolarizzazione del potenziale di membrana (Δψm) (Marchetti et al., 1996; Zamzami et al., 1995b; Zamzami et al., 1996), che sembra essere dovuto all’apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (MPT) (Zoratti e Szabo, 1995). Le proteine rilasciate dai mitocondri apoptotici nel citoplasma poco prima o poco dopo la MPT sono in grado di indurre la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA (Liu et al., 1996; Susin et al, 1996; Zamzami et al., 1996).
La cellula morente si rompe in diversi pezzi rotondi chiusi da membrana chiamati corpi apoptotici che vengono fagocitati e degradati dalle cellule fagocitiche (Savill et al., 1993; Hart et al., 1996). Le cellule epiteliali, le cellule endoteliali e i fibroblasti adiacenti ai siti di apoptosi possono fagocitare i corpi apoptotici. Diversi studi dimostrano anche che i macrofagi “professionali” sono reclutati nei siti di morte cellulare e sono responsabili di gran parte della fagocitosi dei corpi apoptotici (Hopkinson-Woolley et al., 1994; Camp e Martin, 1996). Questa fagocitazione previene una risposta infiammatoria dalla fuoriuscita di detriti cellulari negli spazi intercellulari. Le cellule apoptotiche mostrano una serie di segnali per attirare i fagociti, compresi i cambiamenti nelle molecole della superficie cellulare come zuccheri, lipidi e proteine. Sebbene il riconoscimento fagocitario delle cellule apoptotiche sia un processo critico e un campo di ricerca attivo, i dettagli di questo evento finale dell’apoptosi esulano dallo scopo di questa recensione.
Gli eventi cellulari dell’apoptosi contrastano con quelli della necrosi, sebbene entrambi portino alla morte della cellula (Darzynkiewicz et al., 1997). La necrosi, o morte cellulare accidentale, è caratterizzata dalla morte rapida e quasi istantanea di una cellula a causa di una lesione catastrofica. Le cellule necrotiche si gonfiano fino a raggiungere un grande volume, mostrando un drammatico aumento del volume mitocondriale. La membrana plasmatica è interrotta e il contenuto cellulare viene rilasciato, producendo tipicamente una risposta infiammatoria che danneggia le cellule vicine. La degradazione del DNA a volte si verifica durante la necrosi; tuttavia, i siti di scissione sono casuali, con conseguente gamma completa di dimensioni dei frammenti. I casi di morte cellulare possono spesso essere chiaramente distinti come necrotici o apoptotici, ma in alcuni casi una cellula morente esibisce caratteristiche di entrambi i processi.
Il termine morte cellulare programmata (PCD) è comunemente usato per descrivere la morte delle cellule durante il normale sviluppo di un organismo. Nella maggior parte dei casi, ma non in tutti, la PCD procede con lo stesso processo stereotipato dell’apoptosi; quindi, i termini apoptosi e PCD sono spesso usati in modo intercambiabile. Una pratica alternativa è quella di definire il termine apoptosi come descrittivo di uno dei meccanismi della PCD. In questo capitolo, usiamo il termine apoptosi per descrivere la morte cellulare indotta da stress extracellulari anormali e il termine PCD per indicare la morte cellulare apoptotica che è predestinata allo sviluppo e che si verifica normalmente.