Abstract
Introduzione. Le giovani donne (20-35 anni) sono ad alto rischio di infezione da HPV, anche se la maggior parte delle infezioni sono asintomatiche e vengono eliminate spontaneamente dal sistema immunitario dell’ospite. Queste sono anche il gruppo di donne sessualmente attive e sono nella popolazione delle donne incinte. Durante la gravidanza, i cambiamenti nell’ambiente ormonale e nella risposta immunitaria possono favorire la persistenza dell’infezione da HPV e possono contribuire alla trasmissione transgenerazionale, aumentando così il rischio di cancro. Nel presente studio, abbiamo determinato la prevalenza dell’infezione vaginale da HPV all’inizio della gravidanza e abbiamo cercato di metterla in relazione con l’esito della gravidanza. Materiali e metodi. I campioni citologici vaginali sono stati raccolti dai preservativi usati per coprire la sonda dell’ecografia vaginale durante una visita di routine del primo trimestre in ospedale. Tutte le donne sono state seguite durante la gravidanza e il parto. Gli esiti materni e neonatali sono stati registrati. Risultati. Abbiamo trovato una prevalenza di infezione da HPV intorno al 39,4% nella nostra popolazione. È interessante notare che tutte le donne HPV positive erano infettate da uno o più virus HPV ad alto rischio con una sovrapposizione di rischio intermedio e basso nel 43% e 7,3%, rispettivamente. Le donne con rottura pretermine delle membrane (PPROM) hanno mostrato un’incidenza statisticamente maggiore nel gruppo HPV positivo (7,3%) rispetto al gruppo HPV negativo (3,2%). Conclusione. La prevalenza dell’infezione genitale da HPV è alta durante la gravidanza (circa 40%) ed è stata associata ad una maggiore incidenza di PPROM.
1. Introduzione
Il Papillomavirus umano (HPV) è l’infezione virale a trasmissione sessuale più comune. Sono stati identificati più di 100 tipi umani di HPV che sono noti per infettare le cellule epiteliali tra cui la pelle, la mucosa respiratoria o il tratto genitale. I tipi di HPV specifici per le infezioni del tratto genitale sono classificati in tre categorie di rischio: a basso rischio (6, 11, 40, 42, 43, 44), intermedio (31, 33, 35, 51, 52) e ad alto rischio (16, 18, 45, 56) in base al loro potenziale maligno relativo.
Le donne giovani (20-35 anni) sono al massimo rischio di infezione da HPV, anche se la maggior parte di queste sono asintomatiche e vengono eliminate spontaneamente a causa del forte sistema immunitario. Questa è l’età in cui le donne sono più attive sessualmente. Nei paesi in via di sviluppo questo gruppo di età forma una coorte importante tra la popolazione incinta. Durante la gravidanza il mutato ambiente ormonale e la risposta immunitaria possono favorire la presenza o la persistenza dell’infezione da HPV.
Una revisione sistematica della letteratura ha dimostrato un’ampia variazione nella prevalenza dell’HPV nelle donne incinte dal 5,5 al 65%. L’alta prevalenza in gravidanza può essere attribuita al cambiamento dell’ambiente ormonale e alla diminuzione dell’immunità. In diverse popolazioni, vari HPV sono stati trovati associati alla rottura pretermine delle membrane (PROM), preeclampsia, restrizione della crescita fetale (FGR), parto pretermine e anomalie della placenta. Nessun dato simile è disponibile dal subcontinente indiano che riporta l’associazione di HPV con la gravidanza e il suo esito.
Nel presente studio, abbiamo determinato la prevalenza di infezione vaginale da HPV all’inizio della gravidanza e la sua correlazione con l’esito della gravidanza.
2. Materiale e metodi
Questo studio prospettico è stato condotto in un ospedale universitario per un periodo di venti mesi (novembre 2015-giugno 2016). Il protocollo dello studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale (IEC127/2016). La coorte dello studio comprendeva una popolazione ostetrica casuale che si è presentata a noi nel primo trimestre (fino a 14 settimane) con una gravidanza singolare e aveva intenzione di continuare in un centro per tutta la gravidanza e il parto. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutte le partecipanti. Le donne a cui era stata precedentemente diagnosticata un’infezione da HPV o a cui era stata rilevata una citologia cervicale anormale nel Pap test sono state escluse dallo studio.
2.1. Raccolta dei campioni
I campioni di citologia vaginale sono stati raccolti dai preservativi usati per coprire la sonda dell’ecografia transvaginale (TVS) durante un’ecografia di routine del primo trimestre. I preservativi usati per coprire la sonda TVS sono stati utilizzati, poiché l’esame regolare dello speculum in donne incinte asintomatiche non fa parte delle cure prenatali di routine nella nostra struttura e non è accettabile per molte donne incinte. Tuttavia ogni paziente viene sottoposta a un TVS nel primo trimestre sia per la conferma che per la datazione dello screening delle anomalie precoci del primo trimestre. Il preservativo così ottenuto dopo la TVS è stato immediatamente messo in un contenitore di plastica sterile da 50 cc con una soluzione salina tampone fosfato (PBS), agitato vigorosamente, e il preservativo è stato scartato. La soluzione è stata conservata a 4°C e trattata entro un’ora. Tutte le donne sono state seguite durante la gravidanza e il parto e sono stati registrati gli esiti materni e neonatali.
2.2. Estrazione del DNA
Le provette sono state centrifugate a 2000 giri al minuto per 10 minuti e le cellule impallinate sono state digerite con il tampone di estrazione del DNA e la proteinasi k seguita dal metodo standard di precipitazione con fenolo, cloroformio ed etanolo. La qualità e la quantità del DNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettrofotometria e conservate a -20°C fino all’utilizzo. In media abbiamo potuto estrarre 200-250 ng di DNA dal preservativo usato per coprire la sonda TVS durante l’ecografia del primo trimestre.
2.3. Tipizzazione HPV
Il test HPV DNA è stato eseguito come pubblicato in precedenza. In breve, 100-200 ng di DNA sono stati amplificati tramite PCR annidata usando i primer PGMY09/11 e GP5+/GP6+ con beta globina come controllo interno. Il prodotto della PCR è stato eluito su gel, purificato e sequenziato utilizzando il kit Big Dye terminator (ABI, USA) nell’analizzatore genetico 3130XL (ABI, USA). I tipi di HPV sono stati identificati mediante ricerca NCBI BLAST. La PCR è stata eseguita utilizzando adeguati controlli positivi e negativi. I campioni sono stati classificati come negativi dopo due cicli di test indipendenti.
La positività e il tipo di HPV sono stati poi correlati a varie variabili materne e fetali e agli esiti della gravidanza.
2.4. Metodo statistico
I dati sulle variabili categoriche sono mostrati come n (% dei casi) e i dati sulle variabili continue sono presentati come media e deviazione standard (SD) nei due gruppi di studio. Il confronto intergruppo di variabili categoriche è stato eseguito utilizzando il test Chi-quadrato/il test esatto di probabilità di Fisher. La significatività statistica della differenza intergruppo della media delle variabili continue è testata usando il test “t” a campione indipendente o il test “t” non appaiato. L’assunzione di normalità sottostante è stata testata prima di sottoporre le variabili di studio al test ‘t’. Tutti i dati sono stati inseriti e puliti in MS Excel prima dell’analisi statistica.
I valori p-valori inferiori a 0,05 sono considerati statisticamente significativi. Tutte le ipotesi sono state formulate usando alternative a due code contro ogni ipotesi nulla (ipotesi di nessuna differenza). Tutti i dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando Statistical Package for Social Sciences (SPSS ver 21.0, IBM Corporation; NY, USA) per MS Windows.
3. Risultati
Sono stati raccolti un totale di 115 campioni; tuttavia 104 campioni hanno completato lo studio. Prevalenza di HPV: nella nostra coorte di studio su 41/104 (39,4%) erano HPV positivi, mentre 63/104 (60,6%) sono risultati negativi all’infezione vaginale da HPV. È interessante notare che la tipizzazione dei campioni HPV positivi ha indicato che tutti questi 41 campioni erano positivi ai tipi di HPV ad alto rischio (HPV 16, HPV18, HPV45, HPV56 e HPV97). Diciotto di loro hanno mostrato prove di coinfezione con tipi di HPV a rischio intermedio come HPV 87, HPV35, HPV51, HPV52 e HPV82, mentre solo 3 campioni erano coinfettati con HPV a basso rischio (HPV29, HPV32, HPV54, HPV61, HPV84 e HPV87). I tipi di HPV più frequenti nella nostra coorte erano HPV45 (60%), seguito da HPV18 (48,8%) e HPV16 (43,9%) (Figura 1).
Stato dell’HPV ed esito della gravidanza: per confrontare l’esito della gravidanza nelle donne HPV positive rispetto a quelle HPV negative, abbiamo analizzato la demografia di base nei due gruppi. L’età media (HPV positivo: 28,1±4,6 anni; HPV negativo: 27,3± 3,6 anni) e il numero medio di gravidanze (HPV positivo: 1,7± 1; HPV negativo: 1,7± 0.9) erano comparabili in entrambi i gruppi, mentre gli anni di vita matrimoniale nelle donne incinte HPV positive erano 3,6±2,7 anni ed erano 2,8±2,7 anni nelle donne HPV negative (p<0,05) (Tabella 1).
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Confrontando le complicazioni della gravidanza (Tabella 2) tra i due gruppi, non abbiamo potuto trovare una differenza statisticamente significativa tra aborti, diabete gestazionale e ipertensione o ritardo di crescita fetale. La rottura pretermine delle membrane (PPROM) ha tuttavia mostrato un’incidenza statisticamente maggiore nel gruppo HPV positivo (7,3%), rispetto al gruppo HPV negativo (3,2%). Lo stato dell’HPV tuttavia non differiva tra i due gruppi in termini di età gestazionale al momento del parto, peso alla nascita e punteggi Apgar a 1 minuto e 5 minuti (tabella 3).
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4. Discussione
Abbiamo trovato una prevalenza di HPV di circa 39,4% nelle donne incinte della nostra popolazione. È interessante notare che tutte le donne HPV positive erano infettate da uno o più virus HPV ad alto rischio con una sovrapposizione di rischio intermedio e basso nel 43% e 7,3%, rispettivamente. Lo stato di positività all’HPV è stato visto più frequentemente nelle donne con una vita matrimoniale più lunga (che potrebbe avere una correlazione indiretta con gli anni di attività sessuale) e un BMI più alto.
L’infezione da HPV è comune tra i giovani adulti sessualmente attivi, con una prevalenza stimata tra il 20,0% e il 46,0% . Durante la gravidanza il rischio dovrebbe essere alto a causa del fatto che la gravidanza è una sorta di stato di immunità soppressa. Uno studio prospettico in Brasile ha anche trovato una maggiore prevalenza di infezione da HPV tra le donne incinte (25,3%) rispetto alle donne non incinte (13%).
Nelle donne africane incinte la prevalenza di HPV DNA era del 33,3%. Circa il 62% delle donne HPV-positive erano infettate da tipi di HPV ad alto rischio e/o ad alto rischio possibile o probabile (pHR), conosciuti anche come tipi di HPV a rischio intermedio. I cinque tipi di HPV più prevalenti in questo studio erano HPV-52 e HPV-67, HPV-53, HPV-45 e HPV-18. HPV-16 era raro (1,2%).
HPV in gravidanza è interessante e importante da studiare per due motivi. In primo luogo le infezioni vaginali sono note per influenzare negativamente l’esito della gravidanza. In secondo luogo l’infezione da HPV della placenta è possibile in quanto le cellule del trofoblasto sembrano avere il macchinario per la replicazione dell’HPV e l’afflizione della placenta può causare direttamente il ritardo della crescita fetale, la preeclampsia, gli aborti e le nascite pretermine.
Nella nostra coorte solo l’incidenza di PPROM è risultata maggiore tra le donne incinte HPV positive rispetto a quelle che erano HPV negative. Non c’era alcuna differenza nel rischio di aborti o nascite pretermine (senza PPROM). Anche in altri studi ci sono prove equivoche per l’infezione placentare con HPV che causa disfunzioni placentari che portano ad aborti spontanei e nascite pretermine. Uno studio recente ha concluso che l’infezione materna da HPV non è un fattore di rischio per il parto pretermine o l’ipertensione legata alla gravidanza. Tuttavia, in questo studio la presenza di HPV durante la gravidanza non è stata studiata. Un’analisi retrospettiva è stata eseguita per le donne dopo il parto che avevano risultati di test di screening del cancro cervicale entro tre anni prima del parto. Alla luce di ciò, i risultati devono essere interpretati tenendo presente che nuove infezioni possono essere rilevate in gravidanza a causa del mutato ambiente ormonale e immunitario e la natura transitoria dell’infezione da HPV è comune anche nelle giovani donne. Un altro studio retrospettivo ha trovato un rischio 2 volte maggiore di preeclampsia nelle donne che avevano uno stato di HPV ad alto rischio all’ingresso alle cure prenatali rispetto a quelle con almeno 2 pap test normali.
Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio prospettico dal subcontinente indiano per scoprire la prevalenza di HPV nella nostra popolazione durante la gravidanza e il suo effetto sulla gravidanza e il parto. I fattori che influenzano l’infezione da HPV nel nostro ambiente socioculturale potrebbero essere diversi. Inoltre, anche se lo screening del cancro cervicale con citologia è disponibile in tutta l’India, non è ancora diventato pratico per lo screening della popolazione nel nostro paese. Quindi questo tipo di raccolta semplice e senza sforzo di campioni per lo screening, nella popolazione target durante la gravidanza, è un’area interessante da studiare ulteriormente. Tuttavia, il costo del test HPV deve essere giustificato se viene fatto oltre la periferia della ricerca. Lo screening dell’HPV durante la gravidanza potrebbe anche aiutare a ottimizzare i nostri obiettivi verso una migliore assistenza sanitaria riproduttiva e infantile, dato che abbiamo trovato che è associato a cattivi esiti della gravidanza. Un’altra novità di questo studio è stata la tecnica con cui abbiamo raccolto i campioni dai preservativi utilizzati per coprire la sonda TVS. Nessun altro studio ha menzionato questa tecnica di raccolta dei campioni e la sua fattibilità fino ad oggi, nella letteratura scientifica inglese.
La piccola dimensione della popolazione dello studio è il fattore limitante qui. Altre limitazioni includono solo un test una tantum nel primo trimestre per lo stato dell’HPV. Una nuova infezione da HPV verso il termine o l’eliminazione dell’HPV prima del parto sarebbe interessante da studiare e la sua correlazione con gli esiti della gravidanza potrebbe essere più significativa, così come lo studio del tasso di trasmissione verticale studiando l’affezione placentare e lo stato di HPV del neonato.
5. Conclusione
La prevalenza dell’infezione genitale da HPV è alta (40%) durante la gravidanza ed è stata associata ad una maggiore incidenza di PPROM nel nostro studio. Il preservativo usato per coprire la sonda TVS durante la valutazione ecografica della gravidanza può essere usato per raccogliere campioni per l’individuazione dell’HPV dove le credenze socioculturali proibiscono l’esame diretto dello speculum durante le cure prenatali di routine nelle donne asintomatiche.