METODI
Si tratta di uno studio trasversale condotto per la valutazione dello stato di secretori e non secretori di ABH nella popolazione di Karachi (Pakistan). Centouno studenti adulti sani (76 maschi, 25 femmine) di età compresa tra 15 e 40 anni sono stati selezionati a caso per questo studio. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti gli individui. Questo studio è stato approvato dal comitato etico della Baqai Medical University, Karachi. Dieci ml di saliva sono stati raccolti in contenitori di plastica sterilizzati monouso da tutti gli individui. Cinque ml di sangue (2 ml in provetta EDTA e 3 ml in provetta non anticoagulata) sono stati raccolti da tutti gli individui in modo asettico per il raggruppamento delle cellule e del siero.
Abo e Rh:
Preparazione della sospensione di globuli rossi al 3%: Due ml di sangue raccolti in una provetta EDTA anti-coagulata sono stati centrifugati a bassa velocità (1500 rpm) per 3 minuti. Il plasma è stato trasferito in un’altra provetta e utilizzato per il raggruppamento del siero. La provetta contenente le cellule è stata riempita con soluzione fisiologica normale. La provetta è stata ben mescolata e ricentrifugata a 1500 rpm per 3 minuti. La procedura di lavaggio è stata ripetuta due volte. Durante l’ultimo lavaggio, la provetta è stata centrifugata ad alta velocità (3000rpm) per 3 minuti e il surnatante è stato scartato. Il surnatante trasparente e la comparsa di una linea di trascinamento delle cellule indicano un corretto lavaggio delle cellule.
I: Raggruppamento delle cellule: Tre provette di vetro pulite sono state etichettate come provetta A per anti A, provetta B per anti B e provetta D per anti D. Una goccia di antisiero è stata aggiunta come siero anti A alla provetta A, siero anti B alla provetta B e siero anti D alla provetta D. Una goccia di sospensione di globuli rossi al 3% è stata aggiunta alle provette A, B e D. Tutti i contenuti sono stati ben mescolati. Tutte le provette sono state centrifugate immediatamente bilanciando a 3400 rpm per 15 secondi. Tutte le provette sono state estratte delicatamente e la provetta è stata esaminata individualmente per l’agglutinazione.
II: Raggruppamento del siero: Il siero è stato separato dalla provetta non anticoagulata dopo la centrifugazione per 5 minuti a 3000rmp. Tre provette di vetro pulite sono state etichettate come provetta “a” per le cellule A, provetta “b” per le cellule B e “o” per le cellule O. In ogni provetta sono state aggiunte due gocce di siero individuale. Una goccia di sospensione di globuli rossi nota al 3% di cellule A, B e O è stata aggiunta alle provette “a”, “b” e “o”. Tutti i contenuti delle provette sono stati ben mescolati e immediatamente centrifugati per 15 secondi. Tutte le provette sono state estratte delicatamente e le provette sono state esaminate individualmente per l’agglutinazione.
Tutti i campioni sono stati testati entro 6 ore, utilizzando una sospensione di globuli rossi freschi dello stesso individuo. Raccolta e trattamento della saliva: dieci ml di saliva sono stati raccolti da tutti gli individui in un contenitore di plastica sterilizzato monouso e trasferiti dal contenitore in una provetta di vetro sterilizzata monouso. La provetta contenente la saliva è stata centrifugata a 2000 rpm per 10 minuti. Il surnatante è stato trasferito in un’altra provetta di vetro. Tubo contenente il surnatante di saliva è stato posto in un bagno d’acqua a 56oC per 30 minuti per inattivare l’amilasi salivare. Tubo campione è stato raffreddato e ri-centrifugato per 10 minuti a 2000 rpm. Il surnatante è stato trasferito in un’altra provetta monouso e utilizzato per il test di inibizione dell’emoagglutinazione o di neutralizzazione.
Principio del test di inibizione dell’emoagglutinazione: Le sostanze ABH presenti in forma solubile nei fluidi (ad esempio, la saliva) neutralizzano i loro corrispondenti anticorpi. Gli anticorpi non saranno più in grado di agglutinare i globuli rossi che possiedono gli stessi antigeni.11,12
Procedura del test di inibizione dell’emoagglutinazione:
Preparazione delle diluizioni di raddoppio degli antisieri dei gruppi sanguigni: Dieci provette sono state collocate in un rack etichettato in base al titolo, cioè 1:2 (provetta 1), 1:4 (provetta 2), fino a 1:1024 (provetta 10). A tutte le provette sono stati aggiunti duecento micro litri di soluzione salina. Alla provetta 1 sono stati aggiunti 200 µl di antisiero e mescolati bene. Duecento µl di diluizioni della provetta 1 sono stati trasferiti nella provetta 2 e mescolati bene. La stessa procedura è stata ripetuta dalla provetta 2 alla provetta 10. Duecento µl di antisiero diluito sono stati scartati dalla provetta10. Ogni provetta conteneva la stessa quantità di antisieri e di soluzione salina. Questa soluzione di doppia diluizione è stata usata nel test di inibizione dell’agglutinazione dell’orlo.
Tre file di 10 provette sono state messe in un rack ed etichettate come; I: Provette di doppia diluizione (D/D) II: Provette di controllo (Provette di titolazione) III: Provette di test (Provette di inibizione).
La doppia diluizione di antisieri specifici di gruppo è stata preparata nella fila I. Ogni provetta era etichettata secondo il titolo, cioè 1:2 (provetta1), 1:4 (provetta2) fino a 1:1024 (provetta10). Cento µl di antisiero specifico per il gruppo sanguigno di ogni diluizione sono stati trasferiti nelle provette etichettate in modo corrispondente nelle file II e III come mostrato nella tabella I. Cento µl di soluzione salina sono stati aggiunti a ciascuna provetta della fila II. Ad ogni provetta della fila III sono stati aggiunti cento µl di saliva. Tutte le provette delle file II e III sono state tappate e mescolate bene. Queste provette sono state incubate a 37°C per 30 minuti in un bagno d’acqua con agitazione periodica. Dopo l’incubazione, 100 µl di sospensioni di globuli rossi specifici del gruppo al 3% sono stati aggiunti a ciascuna provetta delle file II e III e sono stati mescolati bene. Tutte le provette sono state incubate a 37°C per 30 minuti. Tutte le provette sono state osservate per l’agglutinazione macroscopicamente sotto una buona fonte di luce.
Interpretazione dei risultati:
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Stato positivo del secretor:
L’agglutinazione macroscopica a titolo più alto (1:128) nel controllo (fila II) e a titolo più basso (1:16) nel test (fila III) ha indicato la presenza di sostanze del gruppo sanguigno nella saliva del test.
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Stato secretorio negativo:
Nessuna differenza nel titolo a cui agglutinazione visibile in entrambe le righe implicava l’assenza di sostanze specifiche del gruppo sanguigno nella saliva per neutralizzare l’antisiero.13
Analisi statistica: Il pacchetto statistico per le scienze sociali (SPSS) versione 17 è stato utilizzato per l’analisi dei dati. La statistica descrittiva è stata utilizzata per il calcolo della frequenza e delle percentuali.