Percorsi di (bio)degradazione degli esplosivi nitroaromatici
TNT, che ha un Θzz positivo, subisce principalmente trasformazioni (bio)nucleofile e riduttive dovute al carattere elettrofilo del nucleo aromatico e dell’atomo N del gruppo nitro (Stenuit e Agathos, 2010). Il frazionamento isotopico C, N e H dei composti nitroaromatici nei materiali del sottosuolo ha confermato che il TNT subisce principalmente una trasformazione riduttiva, mentre la trasformazione del 2,4-DNT, che è caratterizzato da una densità di elettroni superiore a quella del TNT, è dovuta principalmente all’ossigenazione (Wijker et al., 2013).
Di conseguenza, il TNT viene facilmente ridotto a derivati nitroso, idrossilammino e infine amino aromatici attraverso tre successivi trasferimenti di una coppia di elettroni (Stenuit e Agathos, 2010). La fase iniziale di nitroriduzione a quattro elettroni è catalizzata dalle tipiche nitroriduttasi NAD(P)H-dipendenti dall’ossigeno (tipo I) (Stenuit e Agathos, 2010) e dalle transferasi di idruri di tipo I e II della famiglia Old Yellow Enzyme (OYE) (van Dillewijn et al., 2008). È stato suggerito che altri enzimi possano essere ulteriormente coinvolti nell’ultima fase di nitroreduzione a due elettroni per formare l’aminoarene (Riefler e Smets, 2002).
Inoltre, il TNT non è soggetto al convenzionale attacco elettrofilo da parte delle ossigenasi. Al contrario, il TNT è soggetto all’attacco nucleofilo guidato dai superossidi, come è stato osservato con il sistema biomimetico contenente nucleotidi di piridina ridotti e piocianina, un metabolita redox-attivo secreto da Pseudomonas aeruginosa (Stenuit et al., 2009, Stenuit et al., 2012). Inoltre, i σ-addotti anionici del TNT, chiamati anche complessi TNT Meisenheimer, sono facilmente prodotti dalla formazione di un legame covalente tra nucleofili, come la forma caricata negativamente dell’atomo di idrogeno, H- (ione idruro), e l’anello aromatico del TNT. Finora, sono stati caratterizzati diversi enzimi da batteri e piante per catalizzare l’aggiunta nucleofila di ioni idruro all’anello aromatico del TNT, tra cui specifiche transferasi di idruro di tipo II OYE dipendenti dal NAD(P)H (Figura 3(a)) (Beynon et al., 2009, Durchschein et al., 2013) e, in misura molto minore, specifiche transferasi di idruro F420-dipendenti dell’actinomicete (Heiss e Knackmuss, 2002). In seguito al trasferimento di ioni idruro all’anello aromatico del TNT, vengono prodotti complessi di idruro e diidruro Meisenheimer del TNT (-TNT e -TNT, rispettivamente) e possono produrre nitriti e diversi metaboliti denitrati del TNT che tipicamente si accumulano nel mezzo di reazione. Pertanto, anche se l’azoto dal TNT può essere ulteriormente assimilato attraverso l’attività della nitrito reduttasi e la via della glutammina sintetasi-glutammato sintetasi (GS-GOGAT), è stato comunemente osservato che i metaboliti denitrati del TNT non possono essere utilizzati come fonte di carbonio. Il problema intrinseco di un ampio sviamento chimico e metabolico preclude l’emergere di una via di biodegradazione benefica unica per il TNT. Per esempio, i prodotti di condensazione dei metaboliti del TNT possono essere prodotti tra (i) gli isomeri nitroso- e idrossilammino-dinitrotoluene per formare composti tetranitroazoxytoluene come il 4,4′,6,6′-tetranitro-2,2′-azoxytoluene e (ii) gli isomeri idrossilammino-dinitrotoluene e i complessi Meisenheimer protonati diidride del TNT per formare diarilammine secondarie (van Dillewijn et al., 2008). I metaboliti del TNT derivati dalla riduzione della nitro-moiety possono anche subire l’ossidazione della methyl moiety o l’acetilazione della amino-moiety (Stenuit e Agathos, 2010). Questi diversi composti sono comunemente indicati come metaboliti morti perché si accumulano. Inoltre, la formazione di metaboliti suicidi a causa degli effetti tossici degli intermedi e dei prodotti secondari generati dalla riduzione della nitro-moietà sembra essere una delle principali barriere a un metabolismo produttivo del TNT (Lenke et al., 2000).
Figure 3. Biodegradazione di esplosivi nitro catalizzata da (a) alcuni membri della famiglia OYE (es, PETN reduttasi), (b) le reduttasi F420-dipendenti del cluster npd, e (c) il sistema XplA-XplB.
Tuttavia, alcuni autori hanno recentemente riportato percorsi di biodegradazione del TNT vantaggiosi con (i) la produzione del composto metabolizzabile 2,4-dinitrotoluene (2,4-DNT) dal complesso di Meisenheimer monoidro del TNT (Stenuit e Agathos, 2010, Ziganshin et al, 2010a,b) e (ii) l’evidenza utilizzando il sondaggio degli isotopi stabili (SIP) dell’assimilazione di 15 N e 13C dal TNT nel DNA batterico (Gallagher et al., 2010).
Sfruttando le capacità cataboliche dei lieviti Yarrowia lipolytica e Geotrichum candidum e l’acidificazione del mezzo di coltura attraverso la produzione di acidi organici, Ziganshin et al. (2010a,b) hanno riportato la trasformazione in condizioni acide (cioè, a un pH < 4,2) di C3–TNT a 2,4-DNT, un metabolita mineralizzabile TNT-denitrato (Johnson et al, 2002), con concomitante rilascio di nitrito.
Utilizzando DNA-SIP e T-RFLP, Gallagher et al. (2010) hanno riportato l’utilizzo del TNT come fonte di carbonio e azoto in condizioni solfogeniche da parte di un ceppo di Lysobacter taiwanensis inizialmente presente in sedimenti estuarini anaerobici ricchi di organico. Tuttavia, l’incorporazione del TNT nella biomassa cellulare di Lysobacter come substrato primario o come co-substrato (cometabolismo) rimane da chiarire. Anche se sono necessari ulteriori esperimenti in colture asseniche per decifrare le vie di biodegradazione complete catalizzate da L. taiwanensis, la dimostrazione inequivocabile dell’assimilazione batterica anaerobica di N e C dal TNT offre nuove promettenti possibilità di rimedio, come le prove di bioaugmentation degli ambienti anaerobici contaminati dal TNT.
Anche se i percorsi di biodegradazione del TNT riportati in letteratura sono sostenuti esclusivamente dal cometabolismo, specifici batteri dell’ordine Actinomycetales sono stati riportati per utilizzare il TNP come unica fonte di azoto, carbonio ed energia senza riduzione della frazione nitro (ad es, acido picramico, un derivato monoamino del TNP) (Hofmann et al., 2004). La principale via catabolica del TNP è il trasferimento enzimatico dell’idruro al nucleo aromatico seguito da successive reazioni di denitrazione e dall’incanalamento dei metaboliti scissi nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA). Il cluster di geni per la degradazione del TNP (npd cluster) è stato caratterizzato, con l’identificazione di diversi induttori e del regolatore trascrizionale NpdR (Nga et al., 2004). Gli enzimi coinvolti nelle vie cataboliche periferiche del TNP nel Rhodococcus opacus HL PM-1 sono l’idruro transferasi II (HTII), codificata da npdI, e l’idruro transferasi I (HTI), codificata da npdC, che producono rispettivamente il complesso di Meisenheimer monoidruro del TNP (-TNP) e il complesso di Meisenheimer diidruro del TNP (-TNP) (Nga et al., 2004). L’attività di HTII e HTI dipende da una reduttasi F420 dipendente da NADPH (NdfR), codificata da npdG, che agisce come una navetta di elettroni tra NADPH e F420. Come illustrato nella Figura 3(b), il trasferimento di idruro dal coenzima ridotto F420H2 all’anello aromatico di TNP è catalizzato da HTII/HTI (Nga et al., 2004). In Nocardioides simplex FJ2-1A, si verificano le stesse vie cataboliche periferiche del TNP, tranne che un’unica idruro transferasi (HT) catalizza la produzione di -TNP e -TNP (Hofmann et al., 2004). Successivamente, la tautomerasi NpdH, codificata da npdH, catalizza un tautomerismo proton-shift di -TNP per produrre la forma nitro (R2C(- H)NO2) e la forma aci-nitro (R2C=N+(- O-)OH) in equilibrio. Quest’ultima subisce una reazione di denitrazione enzimatica catalizzata da estratti privi di cellule di R. opacus HL PM-1 o N. simplex FJ2-1A (contenente una denitrasi orfana) per formare il complesso di Meisenheimer monoidruro del 2,4-dinitrofenolo (2,4-DNP) (Hofmann et al., 2004). A seguito di una seconda idrogenazione da parte del sistema HTI-NdfR (o HT-NdfR), l’intermedio diidride viene protonato a pH 7,5 per formare 2,4-dinitrocicloesanone, che subisce una scissione catalizzata dall’idrolasi a 4,6-dinitroesanoato. Poiché quest’ultimo può essere infine incanalato verso il ciclo TCA, la biodegradazione del TNP è autosostenuta e può fornire, in siti contaminati da alte concentrazioni di TNP, vantaggi selettivi ai microrganismi degradatori.
Per la biodegradazione dell’analogo del TNT tetrilo, è riconosciuto che la sua idrolisi può produrre TNP, che può subire una biodegradazione microbica completa (Lewis et al., 2004). L’N-denitrazione enzimatica del tetrile in condizioni anaerobiche è stata anche osservata con la formazione di N-metil-2,4,6-trinitroanilina (Myers e Spinnato, 2007), un composto trinitroaromatico per il quale devono essere condotti esperimenti di biodegradabilità.
In conclusione, nessun singolo microbo svolge abbastanza reazioni per trarre un beneficio dalla biodegradazione del TNT (Copley, 2009). L’emergere di un percorso di mineralizzazione può essere più rapido quando diverse reazioni consecutive si trovano all’interno di un singolo microbo. Sebbene sia stata riportata un’eliminazione catalizzata dalla diossigenasi del nitrito come reazione iniziale per il 2,6-DNP (Ecker et al., 1992), l’attacco elettrofilo del 2,4-DNP non è stato finora descritto a causa dell’effetto induttivo negativo del gruppo idrossile e dello specifico ostacolo sterico. Pertanto, l’idrogenazione iniziale del sistema di anelli aromatici è comunemente osservata per il 2,4-DNP e il TNP in modo che la loro biodegradazione sia catalizzata dallo stesso macchinario enzimatico in un singolo microbo. Al contrario, percorsi di biodegradazione dissimili sono stati osservati per gli isomeri di TNT e DNT. Infatti, il 2,4-DNT e il 2,6-DNT sono completamente degradati attraverso una reazione iniziale diossigenasi (Johnson et al., 2002). Di conseguenza, i processi sintropici, per esempio la denitrazione riduttiva del TNT a 2,4-DNT seguita dalla biotrasformazione ossidativa del 2,4-DNT, sono stati proposti come una strategia adatta per ottenere la mineralizzazione del TNT (Tront e Hughes, 2005). Tuttavia, molteplici vie competitive si verificano durante la denitrazione del TNT sia in colture pure che miste e, di conseguenza, portano a metaboliti denitrati senza uscita piuttosto che a isomeri del DNT. In questo contesto, l’evidenza sperimentale della produzione di 2,4-DNT dalla biodegradazione del TNT catalizzata da ceppi di lievito (Ziganshin et al., 2010a,b) può essere di primaria importanza per implementare un processo guidato dalla mineralizzazione del TNT.