Guinguette Marais Poitevin

Costruzione del sistema

Una volta che un bersaglio straniero ha superato la soglia della tolleranza immunitaria, i componenti umorali e cellulari del sistema immunitario dei vertebrati sono chiamati all’azione. Una funzione chiave è la presentazione dell’antigene, che fornisce il meccanismo di riconoscimento e risposta. Le cellule B secernono anticorpi, che si legano a un antigene e lo etichettano, mentre le cellule T svolgono il compito di attaccare le cellule bersaglio. Entrambe le cellule T e B hanno anche un ruolo nella formazione delle cellule della memoria. Come mostrato in Fig. 1, abbiamo diviso questa serie di eventi in tre fasi (riconoscimento e tolleranza, risposta immunitaria e uccisione e memoria) sotto il controllo di quattro componenti funzionali del DNA, compresi i duplex di DNA AM (mimetismo delle cellule presentanti l’antigene (APC)), BM (mimetismo delle cellule B), PG (generatore di primer, che genera i primer per l’anticorpo analogo) e il DNA circolare a singolo filamento CT (template circolare, che controlla la sequenza dell’anticorpo analogo), oltre a due enzimi (la DNA polimerasi Phi29 e l’enzima di restrizione SspI) in grado di rispondere in modo autonomo e programmabile a un pezzo di DNA a singolo filamento (ssDNA) patogeno in entrata (P0) preso dal genoma batterico. Quando non c’è P0, il sistema è mantenuto in uno stato stabile ed equilibrato dal blocco effettivo dei domini funzionali in ogni componente. Tuttavia, quando viene sfidato da P0, questi domini funzionali vengono attivati in una serie di fasi progettate per imitare le tre fasi di cui sopra.

Nel passo 1, in assenza di P0, i componenti funzionali del sistema rimangono in stasi. Imitando la tolleranza immunitaria, lo stato non reattivo della difesa immunitaria, la priorità di reazione di P0 al DNA duplex AM, così come al BM, è controllata attraverso le lunghezze dei loro corrispondenti toeholds, che sono brevi segmenti di overhang ssDNA nei duplex. Di conseguenza, abbiamo progettato un dieci nucleotide (nt) toehold in AM con un tasso di reazione spostamento k di 106 M-1 s-1 e un 0 nt toehold in BM con un valore k di 103 M-1 s-1 per l’ibridazione iniziale P0 17,18. AM può visualizzare P0, che ha due domini ssDNA, uno con una sequenza presa dal genoma del Bacillus anthracis, un batterio Gram-positivo, a forma di asta (P), e l’altro progettato (dominio ssDNA 2-3-4) per controllare le reazioni a valle attraverso una reazione di spostamento del DNA. Tuttavia, nella fase di riconoscimento e tolleranza, il nostro sistema può procedere alla fase 2, la risposta immunitaria, solo quando la quantità di patogeno accumulata supera la soglia di AM.

Una volta raggiunta la soglia di tolleranza immunitaria nel sistema, si attiva la fase 2, la risposta immunitaria umorale analoga. Come notato in precedenza, durante la deplezione di AM dalla reazione di spostamento, uno dei prodotti spostati, ssDNA TM (mimetismo delle cellule T), si accumula e può essere usato come catalizzatore per aumentare la velocità di reazione tra P0 e BM, e quindi rilasciare un primer (dominio ssDNA 12a) per l’amplificazione a cerchi mobili (RCA) catalizzata dalla DNA polimerasi, che questo sistema impiegherà per produrre DNA ‘anticorpo’ mimetico (P*) all’antigene B. anthracis (P). Così, per replicare la risposta immunitaria dell’ospite-difesa, abbiamo incorporato due frammenti di sequenza genomica di B. anthracis (P) nella CT, che ha portato a una rapida generazione delle sequenze complementari P*, essenzialmente per amplificazione enzimatica, utilizzando la DNA polimerasi Phi29, la polimerasi replicativa del fago B. subtilis phi29, e il desossiribonucleotide trifosfato (dNTP), per imitare la generazione veloce e anticorpo-specifica prodotta naturalmente dalle cellule B.

Nella fase 3, uccisione e memoria, del sistema proposto era necessario mimare il processo con cui la risposta immunitaria cellulo-mediata elimina gli agenti patogeni dopo la formazione di un complesso anticorpo-antigene dal corpo, che, come notato sopra, risulta dall’attivazione della risposta immunitaria umorale dai linfociti B. Per realizzare questo, sono stati assunti tre stati infettivi: il filamento patogeno originale P0 e i prodotti di reazione di spostamento (con AM e BM) P1 e P2. Insieme, tutti questi contengono un dominio patogeno infettivo (P). Poi, per formare il complesso anticorpo-antigene nel sistema, il dominio P in P0, P1 e P2 si ibrida con una grande quantità di P* e forma regioni duplex stabili PP*. Tuttavia, anche se il sistema immunitario dell’ospite vertebrato usa la fagocitosi come strategia chiave per rimuovere gli agenti patogeni, abbiamo progettato un metodo puramente biomeccanico per mimare l’attivazione della risposta immunitaria umorale, cioè il legame tra il P* generato e il dominio P dell’agente patogeno, seguito da un passo basato sull’enzima di restrizione che mima l’uccisione mediata dalle cellule tagliando specificamente il duplex ‘anticorpo-antigene’. Più specificamente, quest’ultimo passaggio si realizza quando l’ibridazione del dominio P con P* crea un sito di riconoscimento attivo per l’enzima di restrizione SspI, che viene estratto da un ceppo di E. coli che porta il gene sspi clonato e modificato (Y98F) dal sito di restrizione della specie Sphaerotilus. In questo modo, il dominio P in P0, P1 e P2 può essere specificamente tagliato in due frammenti con i numeri di nucleotide 56 e 15 (rif. 19), perdendo così l’infettività.

In seguito, nel sistema immunitario adattativo, alcune cellule T e B diventeranno cellule della memoria in grado di ‘ricordare’ specifici patogeni. Queste cellule della memoria scateneranno una risposta immunitaria molto più veloce alla successiva esposizione allo stesso patogeno. Pertanto, per creare un meccanismo che imiti la funzione di memoria delle cellule B, ci siamo rivolti al TM ssDNA, che è prodotto dalla reazione di spostamento tra P0 e AM e rimane nel sistema dalla prima esposizione a P0. Descriviamo anche la sua catalisi dello spostamento di P0 e BM per rilasciare rapidamente il primer, e quindi innescare una reazione RCA più veloce che crea l’anticorpo per la prossima esposizione alla stessa sequenza patogena. Questa reazione è definita come guidata dall’entropia perché è quella che evolve spontaneamente verso l’equilibrio termodinamico (Fig. 7 supplementare)18. Senza TM, il tasso di spostamento tra P0 e BM sarebbe rallentato dal blocco effettivo dei domini attivi su BM. Tuttavia, in presenza di TM, BM può ibridarsi con TM attraverso il suo 4 nt toehold (dominio 5 *) e quindi rilasciare l’iniziatore primer ssDNA (PI) e il prodotto laterale W1, che si traduce in una nuova regione di legame toehold (dominio 3 *) per l’ibridazione tra P0 e BM, che è guidato in avanti termodinamicamente dal guadagno entropico delle molecole liberate. Così, l’effetto della memoria è prodotto dall’accelerazione della velocità di reazione tra P0 e BM utilizzando l’effetto catalitico del TM rimanente prodotto dal riconoscimento iniziale. Così, lasciando il TM come “carburante catalitico” nel sistema, si ottiene un effetto di memoria per uno specifico input patogeno.

Verifica della trasduzione del segnale

Per garantire il corretto funzionamento dell’intera rete, la trasduzione del segnale in ogni fase è stata convalidata separatamente. Per esaminare la precisione della funzione di soglia di AM, abbiamo usato un metodo basato sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare l’ordine di ibridazione di P0 con AM e BM. Una coppia di fluoroforo (fluoresceina (FAM)) e quencher (DABCYL (DAB)) è stata accoppiata nel duplex PG per indicare la quantità rilasciata di primer per la reazione RCA. Il ripristino della fluorescenza avviene solo se il livello di soglia di AM viene superato, dopo di che la reazione procede alla fase 2, la risposta immunitaria, basata su reazioni di dislocamento dei filamenti che possono rilasciare il filamento di primer marcato con il quencher. Pertanto, in presenza di 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM fluoroforo/quencher marcato PG, diverse concentrazioni di P0 (da 0 a 150 nM) sono state introdotte nel sistema con monitoraggio della fluorescenza a 517 nm. Come mostrato in Fig. 2b, il ripristino della fluorescenza ha mostrato una brusca impennata alla concentrazione di P0 di 80 nM, ma poco aumento al di sotto di 80 nM, il che indica che la reazione tra P0 e BM era iniziata al punto di esaurimento di AM. In altre parole, il valore di soglia di AM a P0 è regolabile cambiando la concentrazione di AM. In questo caso, il punto di esaurimento, o livello di soglia, di AM è stato raggiunto a 80 nM, indicando che la reazione tra P0 e BM potrebbe iniziare la fase 2, che, negli esseri umani, è la produzione di anticorpi da parte dei linfociti B. Per confermare ulteriormente questo risultato, è stata monitorata la cinetica di fluorescenza del sistema di cui sopra. Inizialmente, 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM PG sono stati mescolati nel buffer, ed è stata aggiunta una piccola quantità di P0 (30 nM). Come risultato della quantità in eccesso di AM e la sua priorità di reazione a P0 dai requisiti del passo 1, si è verificata una cinetica di ripristino della fluorescenza lenta. Tuttavia, quando più P0 (30 nM ogni volta) è stato aggiunto continuamente al sistema, un forte aumento (dopo 90 nM in totale) è stato visto nella cinetica di fluorescenza, che indica che la reazione potrebbe procedere alla fase 2. Sono stati testati diversi valori di soglia cambiando le concentrazioni di AM e BM (Fig. 1 supplementare). L’elettroforesi del gel è stata usata anche per indicare l’ordine delle reazioni (Fig. 2 supplementare). Poiché lo stesso dominio di riconoscimento (2-3-4) è condiviso, risultati sperimentali simili sono stati osservati anche sostituendo P0 con un’altra sequenza patogena, P0-SARS (DNA genomico del coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave) (Fig. 3 supplementare). Tutti i saggi hanno confermato l’effettiva funzione di soglia di AM rispetto alla reazione tra BM e P0, e quindi hanno fornito un mimetismo macroscopico dello stato di “riconoscimento e tolleranza” di AIS.

Un’altra funzione significativa di AM è quello di produrre TM ssDNA catalitico per facilitare la reazione di ibridazione tra P0 e BM, che, secondo Zhang et al.18, può accelerare la reazione di ibridazione da due a quattro ordini di grandezza. ssDNA TM non è solo importante nel facilitare l’ibridazione tra P0 e BM, ma è anche la chiave per la formazione di ‘cellule di memoria mimetica’. Pertanto, per dimostrare l’effetto catalitico di TM, abbiamo continuato a utilizzare il nostro modello di segnalazione basato su FRET, come descritto sopra. Di conseguenza, 80 nM AM, 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB-labelled PG sono stati incubati in tampone. Successivamente, 150 nM P0 sono stati aggiunti al sistema. Abbiamo usato una quantità di P0 in eccesso rispetto ad AM per superare il valore di soglia. Il TM viene generato nella fase 1 come risultato della reazione tra P0 e AM. Così, P0, quando supera la soglia (come impostato controllando la concentrazione di AM), a sua volta provoca una reazione catalitica tra P0 in eccesso e TM per entropia che può rapidamente ripristinare la fluorescenza del sistema. Come confronto, la stessa concentrazione di P0 è stata aggiunta direttamente ad una soluzione con 100 nM BM e 100 nM FAM/DAB-labelled PG, ma senza AM. Come mostrato in Fig. 2d, le misure della cinetica di fluorescenza della reazione catalizzata hanno mostrato un’accelerazione di oltre 500 volte in contrasto con quella senza catalisi18,20. Così, come spiegato sopra, il TM rilasciato potrebbe servire come memoria specifica mimica, che si traduce in una risposta immunitaria più forte e più veloce per la prossima esposizione allo stesso patogeno. Successivamente, abbiamo anche confermato che la quantità di P * generato da amplificazione enzimatica per l’ibridazione con il dominio P in P0, P1 e P2 potrebbe essere determinato dalla quantità di primer, rendendo così la reazione enzimatica controllabile da reazioni a monte in passi 1 e 2 (vedi le informazioni supplementari). Inoltre, la digestione basata sull’enzima di restrizione del complesso antigene-anticorpo generato è stata studiata ed è mostrata nelle Informazioni supplementari.

Prestazioni dell’intero sistema

Dopo aver confermato il corretto funzionamento di ogni passo, abbiamo ulteriormente testato le prestazioni dell’intero sistema con lo stesso filamento patogeno in ingresso dal genoma di B. anthracis (P0). Per confermare la tolleranza di AIRS, una piccola quantità di P0 (100 nM) è stata aggiunta al sistema e la fluorescenza è stata monitorata in tempo reale. Successivamente, abbiamo progettato un segnalatore molecolare di DNA (MB-R) per segnalare la quantità di prodotto RCA in modo fluorescente utilizzando la sequenza genomica P del patogeno B. anthracis come loop. MB-R potrebbe essere aperto dai prodotti RCA, cioè P*, e quindi esibire il ripristino della fluorescenza che rappresenta diverse quantità di P*. La Figura 3a mostra che la cinetica di fluorescenza è simile a quella senza P0, il che conferma che il sistema non si attiva per produrre P* quando la quantità di patogeno è inferiore al livello di tolleranza immunitaria (cioè una soglia di 200 nM). Tuttavia, quando altri 150 nM di P0 sono stati aggiunti al sistema per simulare una seconda esposizione allo stesso patogeno, il ripristino della fluorescenza ha mostrato un comportamento cinetico molto più veloce, che indica la produzione di una grande quantità di P* e un’attivazione riuscita della risposta immunitaria. Inoltre, la risposta più veloce durante la seconda esposizione conferma anche l’effetto memoria di questo sistema per un patogeno specifico. Se P0-SARS viene usato come input patogeno e un segnalatore molecolare codificato con P0-SARS (MB-R-SARS) viene usato come reporter, si vedono tendenze simili di fluorescenza-risposta, come mostrato in Fig. 3b, il che indica che AIRS funziona potenzialmente per un secondo input patogeno. Abbiamo anche usato un diverso sistema di segnalazione a fluorescenza per indicare la quantità di P* generata, che è mostrata nella Fig. 10.

Utilizzando un reporter di fluorescenza in esperimenti indipendenti, AIRS ha dimostrato di operare ugualmente bene con due diversi ingressi di patogeni. Pertanto, abbiamo poi studiato se poteva funzionare anche quando due diversi input venivano presentati simultaneamente. Per fare questa determinazione, P0 e P0-SARS sono stati introdotti insieme a una soluzione che conteneva tutti i componenti (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0,5 U μl-1 Phi29 e 250 μM dNTP). Come nell’esperimento precedente, due diversi beacon molecolari con lo stesso fluoroforo e quencher (MB-R e MB-R-SARS) sono stati aggiunti alla miscela per segnalare le quantità di entrambi i prodotti RCA in modo fluorescente, cioè P* e P*-SARS. Come mostrato nella Fig. 14 supplementare, finché entrambi gli ingressi di patogeni sono al di sotto del livello di tolleranza immunitaria (soglia di 300 nM), AIRS non viene attivato e la fluorescenza rimane invariata rispetto al segnale di fondo. Tuttavia, quando le concentrazioni aumentano a un livello superiore alla soglia per uno o entrambi gli agenti patogeni, la fluorescenza viene ripristinata, il che indica che entrambi gli ingressi di agenti patogeni possono generare un mimetismo anticorpale corrispondente quando sono mescolati insieme. Questo conferma che AIRS ha la capacità di rispondere simultaneamente a due diversi input patogeni.

Per caratterizzare ulteriormente il funzionamento senza errori del sistema AIRS, abbiamo usato l’elettroforesi su gel per analizzare la quantità finale di P*. Come mostrato in Fig. 4a, solo una banda netta di alto peso molecolare può essere vista quando la quantità di patogeno supera il livello di soglia (100 + 150 nM), che è coerente con i precedenti risultati di fluorescenza. Per studiare il legame tra il filamento di ingresso del patogeno (P0) e il filamento mimetico dell’anticorpo (P*) nella fase 3, abbiamo modificato P0 con un fluoroforo (FAM). Dopo la generazione di P*, l’ibridazione tra P0 e P* è stata confermata come una banda di alto peso molecolare potrebbe essere vista nel canale di fluoresceina isotiocianato (FITC) (Fig. 13 supplementare). Con l’aggiunta di più FAM-marcato P0 (da uno a 250 in eccesso) al sistema, l’ibridazione tra l’eccesso P0 e P* generato è stato ancora osservato, il che indica che AIRS potrebbe legare sufficientemente il filamento di ingresso patogeno in eccesso (P0) da RCA. Infine, abbiamo incubato l’enzima di restrizione (2 U µl-1) insieme a tutti gli altri componenti (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 e 250 µM dNTP). Dopo aver introdotto una concentrazione in eccesso di P0 marcato FAM (500 nM) per superare la tolleranza immunitaria del sistema, una banda di frammento di digestione con una modifica FAM (56 nt) è stata scoperta sotto il canale FITC, il che porta alla conclusione che il patogeno era stato digerito con successo (Fig. 4b). È interessante notare che se P0 è sostituito da un ingresso di polimorfismo a doppio nucleotide (P0-mis), il mimetismo anticorpale P* può ancora essere generato con una concentrazione in eccesso di P0-mis. Tuttavia, l’ibridazione tra P0-mis e P* non può essere digerita dall’enzima di restrizione SspI, il che dimostra che il sistema AIRS è sensibile al riconoscimento del polimorfismo nucleotidico dell’input patogeno (Fig. 11 supplementare). AIRS è stato progettato con due strati di selettività, il che rende possibile al sistema di differenziare P0 da un input di polimorfismo a doppio nucleotide, P0-mis. Per spiegare, la capacità di legame relativamente più debole tra P0-mis e P* rispetto a quella tra P0 e P* rende il duplex P0-mis-P* meno stabile. Inoltre, un duplex di mismatch P0-mis-P* non può formare un efficace sito di legame di riconoscimento con l’enzima di restrizione SspI (AAT-ATT), e quindi ridurre il tasso di digestione dell’enzima, che, a sua volta, si traduce in molto meno prodotto di scissione dall’input P0-mis (Fig. 11 supplementare). Al contrario, poiché l’ibridazione di P0-SARS con P* crea un sito di legame di riconoscimento identico a quello dell’enzima di restrizione SspI, sono stati trovati risultati simili di elettroforesi su gel (Fig. 4c), il che conferma ancora una volta che AIRS può funzionare per diversi input patogeni.

Infine, come notato sopra, la specificità del sistema dipende principalmente dall’enzima di restrizione e dalla sequenza di CT (vedi informazioni supplementari). Quando abbiamo sfidato il sistema introducendo P0-SARS marcato FAM come input patogeno, ma CT per B. anthracis come template di amplificazione, nessuna banda fluorescente evidente di alto peso molecolare è apparsa con piccole o grandi quantità di P0-SARS sotto il canale FITC a causa della mancanza di ibridazione tra P0-SARS e P* generato specificamente per B. anthracis (Fig. 12 supplementare).