System construction
異物が免疫寛容の閾値を超えると、脊椎動物の免疫系を構成する体液性および細胞性のコンポーネントが活動を開始する。 主な機能は、認識と反応のメカニズムを提供する抗原提示です。 B細胞は、抗原に結合してタグを付ける抗体を分泌し、T細胞は標的細胞を攻撃する役割を果たす。 また、T細胞とB細胞はともに記憶細胞を形成する役割も担っている。 図1に示すように 図1に示すように、私たちは、この一連の事象を3つのステップ（認識・寛容、免疫応答、殺傷・記憶）に分け、4つの機能的なDNAコンポーネント（DNA二重鎖AM（抗原提示細胞（APC）模倣）、BM（B細胞模倣）、PG（プライマー・ジェネレーター））が制御していることを明らかにした。 さらに、細菌ゲノムから採取した一本鎖DNA（ssDNA）の病原体入力（P0）に自律的かつプログラム可能に反応する2つの酵素（Phi29 DNAポリメラーゼおよびSspI制限酵素）が含まれている。 P0が存在しないときは、各構成要素の機能ドメインが効果的にブロックされることで、システムは安定したバランスのとれた状態に保たれる。 しかし、P0に挑戦されると、これらの機能ドメインは、上記の3つのステップを模倣した一連のステップで活性化されます。
AIRSは3つのステップで構成されています。 (1)認識と寛容、(2)免疫反応、(3)殺傷と記憶。 これらの機能は、ssDNAの病原体の入力（P0）がない状態ではブロックされているが、P0がAIRSシステムに導入されると、DNAのトゥホールを媒介とした一連の鎖の変位とDNA-酵素反応によって駆動される。 色のついた棒は、異なるドメインを持つDNA鎖を示す。 すべてのxドメインはx*と相補的である。P0はssDNAの形で感染能力を持つ病原体の配列である。 AM (antigen-presenting cell mimicry)、BM (B-cell mimicry)、PG (primer generator, アナログ抗体のプライマーを生成する) は、CT (circular template, アナログ抗体の配列を制御する) と、2つの機能的な酵素であるPhi29ポリメラーゼとSspI制限酵素とともに、最初は二重鎖成分として存在する。 TM (T Cell Mimicry); RCA (Rolling Cycle Amplification). P1とP2は置換反応生成物です。
ステップ1では、P0が存在しない状態では、システムの機能的なコンポーネントは静止したままです。 また、P0は、二重鎖DNAのAMやBMに対する反応の優先順位を、対応するtoehold（二重鎖DNAのオーバーハング部分）の長さによって制御している。 そこで我々は、P0の最初のハイブリダイゼーションのために、AMには変位反応速度kが106 M-1 s-1の10ヌクレオチド（nt）のtoeholdを、BMにはk値が103 M-1 s-1の0 ntのtoeholdを設計した17,18。 AMは、グラム陽性で棒状の細菌であるBacillus anthracisのゲノムから取り出した配列を持つP（P）と、DNAの置換反応によって下流の反応を制御するように設計された（ssDNAドメイン2-3-4）の2つのssDNAドメインを持つP0を表示することができる。 しかし、認識・寛容の段階では、私たちのシステムは、蓄積された病原体の量がAMの閾値を超えたときにのみ、ステップ2である免疫応答に進むことができます。
システム内で免疫寛容の閾値に達すると、ステップ2であるアナログ的な体液性免疫応答が活性化されます。 前述のように、置換反応によってAMが枯渇する間に、置換された生成物の1つであるssDNA TM（T細胞模倣）が蓄積され、P0とBMの間の反応速度を上げるための触媒として使用することができ、その結果、DNAポリメラーゼ触媒によるローリングサークル増幅（RCA）のためのプライマー（ssDNAドメイン12a）が放出されます。このプライマーは、本システムが抗原B. anthracis（P）に対するDNA「抗体」模倣（P*）を生成するために採用するものです。
宿主防御免疫反応を再現するために、CTに2つの炭疽菌ゲノム配列断片（P）を組み込み、B細胞が自然に生成する高速かつ抗体特異的な生成を模倣するために、枯草菌ファージの複製ポリメラーゼであるPhi29 DNAポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を用いて、基本的に酵素増幅によって相補的な配列P*を迅速に生成しました。
提案したシステムのステップ3「殺傷と記憶」では、前述のように、Bリンパ球による体液性免疫反応の活性化によって抗体-抗原複合体が体内で形成された後、細胞介在性免疫反応によって病原体が排除されるプロセスを模倣する必要がありました。 そのために、3つの感染状態を想定した。オリジナルの病原体ストランドP0と、置換反応生成物（AM、BMとの）P1、P2である。 これらはすべて、感染性の病原体ドメイン（P）を含んでいる。 そして、システム内で抗体・抗原複合体を形成するために、P0、P1、P2のPドメインが大量のP*とハイブリダイズし、安定な二重鎖領域PP*を形成する。 しかし、脊椎動物の宿主免疫系は、病原体を除去する際の重要な戦略として貪食を用いるが、我々は純粋に生体力学的な方法を用いて、体液性免疫反応の活性化、すなわち生成されたP*と病原体由来のPドメインとの結合を模倣し、その後、「抗体-抗原」二重鎖を特異的に切断することで細胞媒介性の殺傷を模倣する制限酵素ベースのステップを設計した。 より具体的には、この後者のステップは、PドメインとP*とのハイブリダイゼーションにより、制限酵素SspIの活性認識部位が形成されたときに達成される。SspIは、スフェロティラス種の制限部位からクローン化され改変された（Y98F）sspi遺伝子を持つ大腸菌株から抽出される。
次に、適応免疫系では、一部のT細胞とB細胞が特定の病原体を「記憶」できる記憶細胞になります。
次に、適応免疫系では、一部のT細胞やB細胞が記憶細胞となり、特定の病原体を「記憶」することができます。 そこで、B細胞の記憶機能を模倣するメカニズムを構築するために、我々はssDNA TMに注目した。ssDNA TMは、P0とAMの置換反応によって生成され、最初にP0にさらされたときからシステム内に存在する。 TMは、P0とBMの置換反応によって生成され、P0に最初にさらされたときからシステム内に存在している。 この反応は、熱力学的平衡に向かって自発的に進化する反応であるため、エントロピー駆動型と定義される（補足図7）18。 TMがなければ、P0とBMの間の変位速度は、BM上の活性ドメインが効果的にブロックされることで遅くなる。 しかし、TMが存在すると、BMはその4ntのtoehold（ドメイン5*）を介してTMとハイブリダイズし、ssDNAプライマー・イニシエーター（PI）と副生成物のW1を放出することで、P0とBMのハイブリダイゼーションのための新しいtoehold結合領域（ドメイン3*）が形成され、放出された分子のエントロピー利得によって熱力学的に前方へと駆動される。 このように、記憶の効果は、最初の認識で生じた残りのTMの触媒効果を利用して、P0とBMの間の反応速度を速めることによって生じる。
シグナル伝達の検証
ネットワーク全体が正常に動作していることを確認するために、各ステップのシグナル伝達を個別に検証しました。 AMの閾値関数の精度を調べるために、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用した方法で、P0とAMおよびBMとのハイブリダイゼーションの順番を調べた。 蛍光体（フルオレセイン（FAM））とクエンチャー（DABCYL（DAB））のペアをPG二重鎖に結合させ、RCA反応のためのプライマーの放出量を示した。 蛍光の回復は、AMの閾値を超えた場合にのみ起こり、その後は、クエンチャーで標識されたプライマー鎖を放出できる鎖置換反応に基づいて、ステップ2の免疫反応へと反応が進む。 そこで，80nMのAM，100nMのBM，100nMの蛍光体／クエンチャーを標識したPGの存在下で，異なる濃度のP0（0〜150nM）を517nmの蛍光モニタリングを行いながら系内に導入した。 Fig.2bに示すように、P0濃度が80nMになると蛍光復元が急激に上昇したが、80nM以下ではほとんど上昇しなかったことから、AMの枯渇点でP0とBMの反応が始まったと考えられる。 つまり、P0に対するAMの閾値は、AMの濃度を変えることで調整可能なのである。 この場合、AMの枯渇点（閾値）は80nMで到達しており、P0とBMの反応がステップ2（ヒトの場合はBリンパ球による抗体の産生）を開始できることを示している。 この結果をさらに確認するために、上記システムの蛍光動態をモニターした。 最初に、80nMのAM、100nMのBM、100nMのPGを緩衝液中で混合し、少量のP0（30nM）を添加した。 過剰量のAMと、ステップ1の要件によるP0への反応の優先順位の結果、ゆっくりとした蛍光回復の速度が生じた。 しかし、より多くのP0（毎回30nM）を連続的に添加すると、（合計90nM後に）蛍光のカイネティクスに急激な上昇が見られ、ステップ2への反応が可能であることがわかった。 AMとBMの濃度を変えて、異なる閾値をテストした（補足図1）。 また、ゲル電気泳動を用いて、反応の順番を示した（補足図2）。 同じ認識ドメイン（2-3-4）を共有しているため、P0を別の病原体配列であるP0-SARS（severe acute respiratory syndrome coronavirus genomic DNA）に置き換えても同様の実験結果が得られた（Supplementary Fig.3）。 いずれのアッセイでも、BMとP0の反応に対するAMの有効な閾値機能が確認され、AISの「認識と耐性」の状態を巨視的に模倣していることがわかった。
a, ステップ1と2で起こる反応ステップのスキーム。 W2はPIとPGの置換反応による副生成物である。 b, 80 nMのAM、100 nMのBM、100 nMのFAM/DAB標識PGを用いた系で、異なる濃度のssDNA病原体P0を用いた場合の蛍光復元のプロット。 c, 80 nMのAM、100 nMのBM、100 nMのFAM/DAB標識PGを用いた系の速度論実験。 各時点で、30nMのP0を別々に緩衝液に加えた。 d, TMの触媒効果を調べるための速度論的実験。 黒い曲線は、80nMのAM、100nMのBM、100nMのFAM/DAB標識PG、P0なしのバックグラウンドキネティクスを示す。 赤色の曲線は、100nMのBM、100nMのFAM/DAB標識PG、150nMのP0を用いた場合の無触媒反応のキネティックスを示す。 青色の曲線は、80 nMのAM、100 nMのBM、100 nMのFAM/DAB標識PG、150 nMのP0による触媒反応の速度を示している。 a.u., arbitrary units.
AMのもう一つの重要な機能は、P0とBMの間のハイブリダイゼーション反応を促進する触媒的なssDNA TMを生成することであり、Zhangらによると18, ssDNA TMは、P0とBMの間のハイブリダイゼーションを促進するために重要であるだけでなく、「模倣記憶細胞」の形成にも重要な役割を果たしている。 そこで、TMの触媒効果を証明するために、上述したようなFRETベースの報告モデルを引き続き用いた。 したがって、80nMのAM、100nMのBMおよび100nMのFAM/DAB標識PGを緩衝液中でインキュベートした。 その後、150nMのP0を系内に添加した。 閾値を乗り越えるために、AMに対して過剰量のP0を使用した。 TMは、ステップ1でP0とAMが反応した結果、生成される。 このように、P0は（AMの濃度を制御することで設定した）閾値を超えると、今度はエントロピーによって過剰なP0とTMとの間で触媒反応が起こり、系の蛍光を速やかに回復させることができる。 比較として、100nMのBMと100nMのFAM/DAB標識PGを含み、AMを含まない溶液に、同じ濃度のP0を直接加えた。 図2dに示すように、触媒反応の蛍光速度を測定したところ、触媒反応がない場合とは対照的に、500倍以上の加速が見られた18,20。 このように、放出されたTMは特異的な記憶の模倣として機能し、次に同じ病原体にさらされたときに、より強く、より速く免疫反応を起こすことができるのではないかと考えられた。 その後、P0、P1、P2のドメインPとのハイブリダイゼーションを目的とした酵素増幅で生成されるP*の量は、プライマーの量によって決定されるため、ステップ1、2の上流の反応によって酵素反応が制御可能であることも確認した（補足情報参照）。 さらに、生成された抗原抗体複合体の制限酵素による消化についても検討し、補足情報に示した。
システム全体の性能
各ステップが正常に機能することを確認した後、さらにB. anthracisゲノムから同じ病原体鎖を入力してシステム全体の性能を検証した（P0）。 AIRSの耐性を確認するために、少量のP0（100nM）をシステムに添加し、リアルタイムで蛍光をモニターしました。 次に、病原体であるB. anthracisのゲノム配列Pをループにして、RCA産物の量を蛍光で報告するDNA分子ビーコン（MB-R）を設計した。 MB-Rは、RCA製品、すなわちP*によって開かれ、それによってP*の量の違いを表す蛍光の復元を示すことができる。 図3aは、蛍光の動態がP0なしの場合と類似していることを示しており、病原体の量が免疫寛容のレベル（すなわち、200nMの閾値）以下の場合、システムはP*を生成するために活性化されないことが確認された。 しかし、同じ病原体への2回目の暴露を模倣するために、さらに150nMのP0をシステムに加えたところ、蛍光の回復ははるかに速い動態を示した。これは、大量のP*が産生され、免疫反応がうまく引き起こされたことを示している。 さらに、2回目の照射時の反応の速さは、このシステムが特定の病原体に対して記憶効果を持つことを裏付けている。 病原体の入力としてP0-SARSを用い、レポーターとしてP0-SARSをコード化した分子ビーコン（MB-R-SARS）を用いた場合、図3bに示すように、同様の蛍光反応傾向が見られ、AIRSが2回目の病原体の入力に対しても機能する可能性があることが示された。 また、生成されたP*の量を示すために、別の蛍光レポーターを使用した結果を補足図10に示す。
a,b, 抗体模倣P*(P*-SARS)発生の蛍光動態を、異なる濃度のP0(a)とP0-SARS(b)でモニターした。
独立した実験で蛍光レポーターを使用したところ、AIRSは2つの異なる病原体を入力しても同等に動作することが実証されました。 そこで次に、2つの異なる入力が同時に提示された場合にも動作するかどうかを調べました。 この判断をするために、P0とP0-SARSを、すべての成分（300nM AM、300nM BM、300nM PG、50nM CT-P0、50nM CT-P-SARS、0.5 U μl-1 Phi29、250μM dNTP）を含む溶液に一緒に導入した。 上記の実験と同様に、同じ蛍光体とクエンチャーを持つ2つの異なる分子ビーコン（MB-RおよびMB-R-SARS）も混合物に加え、両方のRCA生成物、すなわちP*およびP*-SARSの量を蛍光で報告した。 補足図14に示すように、両方の病原体の入力が免疫寛容のレベル（300nMの閾値）以下である限り、AIRSは活性化されず、蛍光はバックグラウンド信号と比較して変化しない。 しかし、どちらか一方、または両方の病原体の閾値よりも高いレベルまで濃度が上昇すると、蛍光が回復する。これは、両方の病原体の入力が一緒に混合されると、対応する抗体模倣を生成できることを示している。
AIRSシステムがエラーなく動作していることをさらに確認するために、ゲル電気泳動を用いて最終的なP*の量を分析しました。 Fig.4aに示すように、病原体の量が閾値（100 + 150 nM）を超えると、高分子量の鋭いバンドが1本だけ見られ、これは以前の蛍光の結果と一致しています。 ステップ3の病原体入力鎖（P0）と抗体模倣鎖（P*）の結合を調べるために、P0を蛍光体（FAM）で修飾した。 P*の生成後、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）のイメージングチャンネルに高分子量のバンドが確認できたことから、P0とP*のハイブリダイゼーションが存在することが確認できた（補足図13）。 さらに、FAM標識したP0を追加（1から250過剰）しても、過剰なP0と生成したP*とのハイブリダイゼーションが観察されたことから、AIRSはRCAによって過剰な病原体の入力鎖（P0）を十分に結合できることがわかった。 最後に、制限酵素（2 U µl-1）を他の全成分（200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0.5 U µl-1 Phi29, 250 µM dNTP）とともにインキュベートした。 システムの免疫寛容度を超える過剰濃度のFAM標識P0（500 nM）を導入したところ、FITCチャンネル下にFAM修飾を受けた消化断片バンド（56nt）が発見され、病原体の消化が成功したと結論づけられた（図4b）。 興味深いことに、P0を二塩基多型の入力（P0-mis）で置換しても、P0-misの過剰濃度で抗体模倣P*を生成することができる。 しかし、P0-misとP*のハイブリダイゼーションはSspI制限酵素で消化されないことから、AIRSシステムは病原体の入力の塩基多型の認識に敏感であることがわかる（補足図11）。 AIRSは2層の選択性を持つように設計されており、このシステムはP0を二重のヌクレオチド多型の入力であるP0-misと区別することが可能である。 説明すると、P0-misとP*の間の結合力は、P0とP*の間の結合力に比べて相対的に弱いため、P0-mis-P*二重鎖の安定性が低くなります。 さらに、P0-mis-P*ミスマッチ二重鎖は、制限酵素SspI（AAT-ATT）と有効な認識結合部位を形成することができず、その結果、酵素の消化速度が低下し、入力されたP0-misからの切断産物の量が大幅に減少する（補足図11）。 一方、P0-SARSとP*とのハイブリットにより、制限酵素SspIと同一の認識結合部位が形成されるため、同様のゲル電気泳動結果が得られ（図4c）、AIRSが異なる病原体の入力に対しても機能することが改めて確認された。
a, アガロースゲル(1.5%)による抗体擬態P*生成の解析。 L, 100塩基対のラダー。 エチジウムブロマイド（EB）イメージングチャネル（λ励起＝520nm、λ発光＝605nm）下で撮影した。 b, アガロースゲル（1％）による病原体鎖P0を用いたAIRSアナログシステム性能の検証。 Mは、AIRSに含まれる元々存在する成分の混合物である。 ここで、Mは、200nM AM、200nM BM、200nM PG、50nM CT、0.5 U µl-1 Phi29、250µM dNTPの混合物であり、インキュベーション時間は1時間である。 レーン1、M＋0 nM FAM標識P0、レーン2、M＋100 nM FAM標識P0、レーン3、M＋500 nM FAM標識P0、レーン4、M＋100 nM FAM標識P0＋2 U µl-1 SspI、レーン5、M＋500 nM FAM標識P0＋2 U µl-1 SspI、L、1kbラダー。 c, アガロースゲル(1%)による病原体ストランドP0-SARSを用いたAIRSアナログシステムの性能の検証。 M = 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0.5 U µl-1 Phi29, 250 µM dNTPの混合物; インキュベーション時間, 1時間。 レーン1、M + 0 nM FAM標識P0-SARS、レーン2、M + 100 nM FAM標識P0-SARS、レーン3、M + 500 nM FAM標識P0-SARS、レーン4、M + 100 nM FAM標識P0-SARS + 2 U µl-1 SspI、レーン5、M + 500 nM FAM標識P0-SARS + 2 U µl-1 SspI、L、1 kb ladder。
最後に、上述したように、本システムの特異性は主に制限酵素とCTの配列に依存する（補足情報参照）。 病原体としてFAM標識したP0-SARSを、増幅テンプレートとしてB. anthracis用のCTを導入してシステムに挑戦したところ、B. anthracis用に特異的に生成されたP0-SARSとP*との間でハイブリダイゼーションが起こらないため、少量のP0-SARSでも多量のP0-SARSでも、FITCチャンネル下に明らかな高分子量の蛍光バンドは現れなかった（補足図12）
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