II Przegląd morfologii i wydarzeń molekularnych apoptozy
Apoptotyczna śmierć komórki może być podzielona na cztery sekwencyjne etapy: inicjacja, decyzja o śmierci, wykonanie i wchłonięcie. Szereg stresów komórkowych może zapoczątkować apoptozę poprzez aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych lub uwolnienie drugich komunikatorów. Niektóre przykłady czynników wyzwalających śmierć komórki to promieniowanie jonizujące, leki chemoterapeutyczne, hipertermia i pozbawienie czynników wzrostu. Cząsteczki prezentowane przez inne komórki, takie jak ligand Fas (FasL) i czynnik martwicy nowotworów (TNF), mogą również indukować apoptozę w komórkach posiadających odpowiednie receptory. Komórka może otrzymywać jednocześnie wiele różnych sygnałów, w tym zarówno sygnały proliferacji, jak i śmierci komórki. W odpowiedzi na te sygnały komórka musi ocenić swoją sytuację i zdecydować, czy popełnić samobójstwo poprzez apoptozę. Kluczowymi cząsteczkami regulacyjnymi na tym etapie są członkowie rodziny białek Bcl-2 (White, 1996; Yang i Korsmeyer, 1996), chociaż mechanizm ich działania nie jest w pełni poznany. Po podjęciu przez komórkę decyzji o śmierci, aktywowane są cząsteczki pełniące rolę katów. We wszystkich badanych typach apoptozy, u różnych organizmów wielokomórkowych, katalizatorami są proteazy cytozolowe, z których większość należy do rodziny zwanej kaspazami (Nicholson i Thornberry, 1997; Alnemri, 1997). Proteazy te atakują specyficzne białka komórkowe, co prowadzi do nieodwracalnego zniszczenia krytycznych procesów i struktur komórkowych. W końcowym etapie apoptozy resztki umierającej komórki są rozpoznawane, pochłaniane i degradowane przez sąsiednią komórkę lub makrofaga.
Zmiany morfologiczne związane z apoptozą są wyraźne i dobrze scharakteryzowane (Wyllie, 1987; Darzynkiewicz i in., 1997). Komórki ulegające apoptozie gwałtownie kurczą się i zwężają, odrywając się od sąsiednich komórek. W wyniku utraty objętości cytoplazmy błona plazmatyczna tworzy wypukłości i wgłębienia, nadając komórce wygląd pęcherzykowaty. Powszechnie obserwowany jest również szybki wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia (Schwartzman i Cidlowski, 1993). Błona jądrowa zaokrągla się, a chromatyna kondensuje się i agreguje w gęste, przypominające półksiężyce kształty w pobliżu błony jądrowej. Kondensacja chromatyny związana jest z dwuniciowym rozszczepieniem DNA przez jedną lub więcej endonukleaz jądrowych (Wyllie i in., Montague i Cidlowski, 1996) oraz degradacją laminy jądrowej przez proteazy (Lazebnik i in., 1995).
Degradacja DNA podczas apoptozy zachodzi w precyzyjnym, powtarzalnym wzorcu (Wyllie i in., 1992; Montague i Cidlowski, 1996). Początkowo chromosomalny DNA jest rozszczepiany na duże segmenty o długości około 50-300 kilobaz (Oberhammer i in., 1993). W większości, ale nie we wszystkich przypadkach apoptozy, domeny te są następnie dalej trawione na mniejsze fragmenty przez rozszczepienie pomiędzy nukleosomami. Wydzielanie DNA z jąder apoptotycznych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym daje charakterystyczny wzór tych mono- lub oligonukleosomalnych fragmentów w wielokrotnościach 185-200 par zasad (bp), opisywanych jako drabina DNA (Tilly i Hsueh, 1993). Endonukleazy odpowiedzialne za tę fragmentację DNA nie zostały w sposób przekonujący zidentyfikowane, chociaż sugeruje się istnienie kilku kandydatów (Montague i Cidlowski, 1996). Niektóre badania sugerowały rolę DNazy I lub II, ale enzymy te nie są normalnie zlokalizowane w jądrze. Być może lepszym kandydatem jest 18 kD Ca2 +/Mg2 +-zależna endonukleaza zwana NUC18, która została wyizolowana z apoptotycznych ekstraktów jądrowych i okazała się wysoce homologiczna do cyklofiliny A. NUC18 może być odpowiedzialna za rozszczepianie DNA na fragmenty o masie 50 kD. Ponadto, zidentyfikowano nową, 95 kD Ca2 +/Mg2 +-zależną endonukleazę, która jest aktywna podczas apoptozy (Pandey i in., 1997). Z komórek HeLa wyizolowano również białko zwane czynnikiem fragmentacji DNA (DFF), które wydaje się aktywować endonukleazę(y) apoptotyczną(e) (Liu i in., 1997).
Zmiany w mitochondriach komórek apoptotycznych poprzedzają kondensację komórek i rozpad jądra i mogą być istotnym wczesnym wydarzeniem w apoptozie (Petit i in., 1996; Kroemer, 1997). Mitochondria wykazują depolaryzację potencjału błonowego (Δψm) (Marchetti i in., 1996; Zamzami i in., 1995b; Zamzami i in., 1996), co wydaje się być spowodowane otwarciem mitochondrialnych porów przepuszczalności (MPT) (Zoratti i Szabo, 1995). Białka uwalniane z apoptotycznych mitochondriów do cytoplazmy tuż przed lub tuż po MPT są zdolne do indukowania kondensacji chromatyny i fragmentacji DNA (Liu i in., 1996; Susin i in.., 1996; Zamzami i in., 1996).
Komórka umierająca rozpada się na kilka okrągłych kawałków otoczonych błoną, zwanych ciałkami apoptotycznymi, które są fagocytowane i degradowane przez komórki fagocytujące (Savill i in., 1993; Hart i in., 1996). Komórki nabłonka, śródbłonka i fibroblasty przylegające do miejsc apoptozy mogą pochłaniać ciała apoptotyczne. W kilku badaniach wykazano również, że „profesjonalne” makrofagi są rekrutowane do miejsc śmierci komórek i są odpowiedzialne za znaczną część fagocytozy ciał apoptotycznych (Hopkinson-Woolley i in., 1994; Camp i Martin, 1996). To pochłanianie zapobiega odpowiedzi zapalnej spowodowanej wyciekiem resztek komórkowych do przestrzeni międzykomórkowych. Komórki apoptotyczne wykazują szereg sygnałów przyciągających fagocyty, w tym zmiany w cząsteczkach powierzchni komórkowej, takich jak cukry, lipidy i białka. Chociaż fagocytarne rozpoznawanie komórek apoptotycznych jest krytycznym procesem i aktywnym polem badań, szczegóły tego końcowego wydarzenia w apoptozie wykraczają poza zakres tego przeglądu.
Zdarzenia komórkowe apoptozy różnią się od tych w nekrozie, chociaż oba ostatecznie prowadzą do śmierci komórki (Darzynkiewicz i in., 1997). Nekroza, czyli przypadkowa śmierć komórki, charakteryzuje się szybką, niemal natychmiastową śmiercią komórki w wyniku katastrofalnego urazu. Komórki nekrotyczne pęcznieją do dużych rozmiarów, wykazując dramatyczny wzrost objętości mitochondriów. Błona plazmatyczna zostaje przerwana, a zawartość komórki zostaje uwolniona, co zazwyczaj wywołuje odpowiedź zapalną, która uszkadza sąsiednie komórki. Degradacja DNA czasami występuje podczas nekrozy; jednakże miejsca rozszczepienia są przypadkowe, co skutkuje pełnym zakresem rozmiarów fragmentów. Przypadki śmierci komórki często mogą być wyraźnie rozróżnione jako nekrotyczne lub apoptotyczne, ale w niektórych przypadkach umierająca komórka wykazuje cechy obu procesów.
Termin zaprogramowana śmierć komórki (PCD) jest powszechnie używany do opisania rozpadu komórek podczas normalnego rozwoju organizmu. W większości przypadków, ale nie we wszystkich, PCD przebiega według tego samego stereotypowego procesu co apoptoza; dlatego terminy apoptoza i PCD są często używane zamiennie. Alternatywną praktyką jest definiowanie terminu apoptoza jako opisującego jeden z mechanizmów PCD. W całym tym rozdziale używamy terminu apoptoza do opisania śmierci komórek indukowanej przez nieprawidłowe stresy pozakomórkowe, a terminu PCD do wskazania apoptotycznej śmierci komórek, która jest rozwojowo predestynowana i normalnie zachodząca.