Liczba mikrotubul przyłączonych do jednego kinetochoru jest zmienna: u Saccharomyces cerevisiae tylko jedna MT wiąże się do każdego kinetochoru, podczas gdy u ssaków do każdego kinetochoru może być przyłączonych 15-35 MT. Jednak nie wszystkie MT w wrzecionie przylegają do jednego kinetochoru. Istniej± MT, które rozci±gaj± się od jednego centrosomu do drugiego (i to one odpowiadaj± za długo¶ć wrzeciona), a niektóre krótsze s± wplatane pomiędzy długie MT. Profesor B. Nicklas (Duke University), wykazał, że jeśli za pomocą wiązki laserowej przerwie się połączenie MT-kinetochore, chromatydy nie mogą się już przemieszczać, co prowadzi do nieprawidłowego rozmieszczenia chromosomów. Eksperymenty te pokazały również, że kinetochory maj± biegunowo¶ć i że przył±czenie kinetochorów do MT wychodz±cych z jednego lub drugiego centrosomu będzie zależało od ich orientacji. Ta specyficzno¶ć gwarantuje, że tylko jedna chromatyda przejdzie na każd± stronę wrzeciona, zapewniaj±c tym samym prawidłowe rozmieszczenie materiału genetycznego. Tak więc jedną z podstawowych funkcji kinetochoru jest zakotwiczenie MT do wrzeciona, co jest niezbędne do prawidłowej segregacji chromatyd siostrzanych. Jeśli zakotwiczenie jest nieprawidłowe, może dojść do błędów generujących aneuploidię, co ma katastrofalne skutki dla komórki. Aby temu zapobiec, istnieją mechanizmy wykrywania i korygowania błędów (jak punkt kontrolny montażu wrzeciona), których elementy znajdują się również na kinetochorach. Przemieszczenie jednej chromatydy w kierunku centrosomu powstaje przede wszystkim w wyniku depolimeryzacji MT w miejscu wi±zania z kinetochorem. Te ruchy wymagają również generowania siły, angażując silniki molekularne, które również znajdują się na kinetochorach.
Zakotwiczanie chromosomów do MTs we wrzecionie mitotycznymEdit
Wychwytywanie MTsEdit
Podczas fazy syntezy (faza S) w cyklu komórkowym centrosom zaczyna się powielać. Tuż na początku mitozy oba centriole w każdym centrosomie osiągają maksymalną długość, centrosomy rekrutują dodatkowy materiał i zwiększa się ich zdolność nukleacji mikrotubul. W miarę postępu mitozy oba centrosomy rozdzielają się, tworząc wrzeciono mitotyczne. W ten sposób wrzeciono w komórce mitotycznej ma dwa bieguny emanujące mikrotubule. Mikrotubule są długimi białkowymi filamentami o asymetrycznych końcach: koniec „minusowy”(-) jest względnie stabilny przy centrosomie, a koniec „plusowy”(+) przechodzi na przemian fazy wzrostu i kurczenia się, badając centrum komórki. Podczas tego procesu poszukiwania, mikrotubula może napotkać i uchwycić chromosom przez kinetochor. Mikrotubule, które znajd± i przył±cz± się do kinetochoru stabilizuj± się, podczas gdy mikrotubule pozostaj±ce wolne ulegaj± szybkiej depolimeryzacji. Ponieważ chromosomy maj± dwa kinetochory powi±zane ze sob± (po jednym na każdej chromatydzie siostrzanej), gdy jeden z nich przywi±że się do mikrotubul generowanych przez jeden z biegunów komórkowych, kinetochor na chromatydzie siostrzanej zostaje wystawiony na działanie bieguna przeciwnego; Z tego powodu w większości przypadków drugi kinetochor zostaje przyłączony do mikrotubul pochodzących z przeciwległego bieguna, w taki sposób, że chromosomy są teraz zorientowane dwukierunkowo, w jednej podstawowej konfiguracji (określanej również jako amfiteliczna), aby zapewnić prawidłową segregację obu chromatyd, gdy komórka się podzieli.
Gdy tylko jedna mikrotubula jest zakotwiczona do jednego kinetochoru, rozpoczyna się gwałtowny ruch związanego z nią chromosomu w kierunku bieguna generującego tę mikrotubulę. W tym ruchu prawdopodobnie pośredniczy aktywność motoryczna w kierunku „minusa” (-) białka motorycznego dyneiny cytoplazmatycznej, która jest bardzo skoncentrowana w kinetochorach niezakotwiczonych do MT. Ruch w kierunku bieguna ulega spowolnieniu, o ile kinetochory nabędą kMTs (MTs zakotwiczone do kinetochorów), a ruch staje się ukierunkowany przez zmiany długości kMTs. Dyneina jest uwalniana z kinetochorów w miarę nabywania przez nie kMTs i w hodowlanych komórkach ssaków jest wymagana do inaktywacji wrzecionowego punktu kontrolnego, ale nie do kongresji chromosomów na równiku wrzeciona, nabywania kMTs lub anafazy A podczas segregacji chromosomów. U roślin wyższych i drożdży nie ma dowodów na obecność dyneiny, ale inne kinezyny w kierunku końca (-) mogą kompensować brak dyneiny.
Innym białkiem motorycznym zaangażowanym w początkowe wychwytywanie MT jest CENP-E; jest to kinezyna o wysokiej masie cząsteczkowej związana z koroną włóknistą na kinetochorach ssaków od prometafazy do anafazy. W komórkach z niskim poziomem CENP-E chromosomy pozbawione są tego białka na swoich kinetochorach, które dość często wykazują defekt w zdolności do kongresji na płytce metafazowej. W takim przypadku niektóre chromosomy mogą pozostać chronicznie mono-orientowane (zakotwiczone tylko do jednego bieguna), chociaż większość chromosomów może prawidłowo kongresować na płytce metafazowej.
Powszechnie przyjmuje się, że włókno kMTs (wiązka mikrotubul związana z kinetochorem) powstaje w wyniku wychwytu MTs spolimeryzowanych przy centrosomach i biegunach wrzeciona w komórkach hodowlanych ssaków. Jednakże MTs polimeryzowane bezpośrednio przy kinetochorach mogą również wnosić znaczący wkład. Sposób, w jaki region centromerowy lub kinetochor inicjuje powstawanie kMT i częstotliwo¶ć, z jak± to się dzieje, s± ważnymi pytaniami, ponieważ mechanizm ten może przyczyniać się nie tylko do pocz±tkowego powstawania kMT, ale także do sposobu, w jaki kinetochory koryguj± wadliwe zakotwiczenie MTs i reguluj± ruch wzdłuż kMT.
Rola kompleksu Ndc80Edit
MT związane z kinetochorami prezentują szczególne cechy: w porównaniu do wolnych MT, kMT są znacznie bardziej odporne na depolimeryzację wywołaną zimnem, wysokie ciśnienie hydrostatyczne lub ekspozycję na wapń. Ponadto, kMT podlegają recyklingowi znacznie wolniej niż MTs astralne i MTs wrzecionowe z wolnymi (+) końcami, a jeśli kMTs są uwalniane z kinetochorów za pomocą wiązki laserowej, szybko ulegają depolimeryzacji.
Gdy stało się jasne, że ani dyneina ani CENP-E nie są niezbędne do tworzenia kMTs, inne cząsteczki powinny być odpowiedzialne za stabilizację kMTs. Pionierskie prace genetyczne w drożdżach ujawniły znaczenie kompleksu Ndc80 w zakotwiczaniu kMTs. W Saccharomyces cerevisiae, kompleks Ndc80 składa się z czterech komponentów: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p i Spc25p. Mutanty pozbawione któregokolwiek z komponentów tego kompleksu wykazuj± utratę poł±czenia kinetochore-mikrotubule, chociaż struktura kinetochore nie jest całkowicie utracona. Jednak mutanty, w których struktura kinetochorowa jest utracona (na przykład mutanty Ndc10 w drożdżach) wykazują brak zarówno połączenia z mikrotubulami, jak i zdolności do aktywacji wrzecionowego punktu kontrolnego, prawdopodobnie dlatego, że kinetochory działają jako platforma, na której montowane są składniki odpowiedzi.
Kompleks Ndc80 jest wysoce konserwatywny i został zidentyfikowany w S. pombe, C. elegans, Xenopus, kurczakach i ludziach. Badania nad Hec1 (highly expressed in cancer cells 1), ludzkim homologiem Ndc80p, wykazały, że jest on ważny dla prawidłowej kongregacji chromosomów i progresji mitotycznej oraz że oddziałuje z elementami kompleksów kohezyny i kondensyny.
Różne laboratoria wykazały, że kompleks Ndc80 jest niezbędny do stabilizacji zakotwiczenia kinetochor-mikrotubul, wymaganego do podtrzymania napięcia centromerycznego, implikowanego w ustanowieniu prawidłowej kongresji chromosomów u wysokich eukariontów. Komórki z upośledzoną funkcją Ndc80 (przy użyciu RNAi, nokautu genów lub mikroiniekcji przeciwciał) mają nieprawidłowo długie wrzeciona, brak napięcia między siostrzanymi kinetochorami, chromosomy niezdolne do zgromadzenia się na płytce metafazowej i niewiele lub jakiekolwiek związane z nimi kMT.
Istnieje wiele silnych dowodów na zdolność kompleksu Ndc80 do bezpośredniego łączenia się z mikrotubulami i tworzenia głównego konserwowanego składnika interfejsu kinetochor-mikrotubula. Jednakże, tworzenie silnych interakcji kinetochor-mikrotubule może wymagać również funkcji dodatkowych białek. W drożdżach, to poł±czenie wymaga obecno¶ci kompleksu Dam1-DASH-DDD. Niektórzy członkowie tego kompleksu wiążą się bezpośrednio do MTs, podczas gdy inni wiążą się do kompleksu Ndc80. Oznacza to, że kompleks Dam1-DASH-DDD może być niezbędnym adapterem pomiędzy kinetochorami a mikrotubulami. Jednakże u zwierząt nie zidentyfikowano równoważnego kompleksu i kwestia ta jest nadal przedmiotem intensywnych badań.
Weryfikacja zakotwiczenia kinetochore-MTEdit
Podczas fazy S komórka powiela całą informację genetyczną przechowywaną w chromosomach, w procesie określanym jako replikacja DNA. Pod koniec tego procesu każdy chromosom zawiera dwie siostrzane chromatydy, które są dwiema kompletnymi i identycznymi cząsteczkami DNA. Obie chromatydy pozostają połączone kompleksami kohezyny aż do anafazy, kiedy to następuje segregacja chromosomów. Jeśli segregacja chromosomów przebiega prawidłowo, każda komórka potomna otrzymuje kompletny zestaw chromatyd. Aby tak się stało, każda chromatyda siostrzana musi zakotwiczyć się (poprzez odpowiedni kinetochor) do MT wytworzonych w przeciwległych biegunach wrzeciona mitotycznego. Konfiguracja ta określana jest jako amfiteliczna lub dwukierunkowa.
Podczas procesu zakotwiczenia mogą jednak pojawić się również pewne nieprawidłowe konfiguracje:
- monoteliczna: tylko jedna z chromatyd jest zakotwiczona do MTs, drugi kinetochor nie jest zakotwiczony; w tej sytuacji nie występuje napięcie centromerowe, a wrzecionowy punkt kontrolny zostaje aktywowany, opóźniając wejście w anafazę i dając komórce czas na skorygowanie błędu. Jeśli nie zostanie skorygowany, niezakotwiczony chromatyd może losowo zakończyć się w którejś z dwóch komórek potomnych, generując aneuploidię: jedna komórka potomna będzie miała nadmiar chromosomów, a drugiej będzie brakowało niektórych chromosomów.
- synteliczny: obie chromatydy są zakotwiczone do MTs wychodzących z tego samego bieguna; ta sytuacja również nie generuje napięcia centromerowego, a wrzecionowy punkt kontrolny zostanie aktywowany. Jeśli nie zostanie on skorygowany, obie chromatydy zakończą się w tej samej komórce potomnej, generując aneuploidię.
- meroteliczny: co najmniej jeden chromatyd jest zakotwiczony jednocześnie do MT wychodzących z obu biegunów. Sytuacja ta generuje napięcie centromerowe i z tego powodu punkt kontrolny wrzeciona nie jest aktywowany. Jeśli nie zostanie to skorygowane, chromatyd związany z obydwoma biegunami pozostanie jako chromosom opóźniony w anafazie, a w końcu ulegnie rozpadowi na dwa fragmenty, które zostaną rozdzielone pomiędzy komórki potomne, generując aneuploidię.
Obu konfiguracjom monotelicznym i syntelicznym nie udaje się wygenerować napięcia centromerowego i są one wykrywane przez wrzecionowy punkt kontrolny. W przeciwieństwie do tego, konfiguracja meroteliczna nie jest wykrywana przez ten mechanizm kontrolny. Większość z tych błędów jest jednak wykrywana i korygowana zanim komórka wejdzie w anafazę. Kluczowym czynnikiem w korekcji tych błędów zakotwiczenia jest kompleks pasażera chromosomalnego, w skład którego wchodzi białko kinazowe Aurora B, jego docelowa i aktywująca podjednostka INCENP oraz dwie inne podjednostki, Survivin i Borealin/Dasra B (omówione przez Adams i współpracowników w 2001 r.). Komórki, w których funkcja tego kompleksu została zniesiona przez mutacje dominuj±co ujemne, RNAi, mikroiniekcję przeciwciał lub zastosowanie leków selektywnych, gromadz± błędy w zakotwiczeniu chromosomów. Wiele badań wykazało, że Aurora B jest niezbędna do destabilizacji nieprawidłowego zakotwiczenia kinetochore-MT, sprzyjaj±c powstawaniu poł±czeń amfitelektonicznych. Homolog Aurory B w drożdżach (Ipl1p) fosforyluje niektóre białka kinetochorowe, takie jak konstytutywne białko Ndc10p oraz członkowie kompleksów Ndc80 i Dam1-DASH-DDD. Fosforylacja elementów kompleksu Ndc80 powoduje destabilizację zakotwiczenia kMTs. Zaproponowano, że lokalizacja Aurory B jest istotna dla jej funkcji: ponieważ jest ona zlokalizowana w wewnętrznym regionie kinetochorów (w heterochromatynie centromerowej), gdy napięcie centromerowe jest ustalone siostrzane kinetochory rozdzielają się, a Aurora B nie może dotrzeć do swoich substratów, co powoduje stabilizację kMT. Aurora B ulega częstej nadekspresji w kilku typach nowotworów i jest obecnie celem dla rozwoju leków przeciwnowotworowych.
Aktywacja wrzecionowego punktu kontrolnegoEdit
Wrzecionowy punkt kontrolny, lub SAC (od spindle assembly checkpoint), znany również jako mitotyczny punkt kontrolny, jest mechanizmem komórkowym odpowiedzialnym za wykrywanie:
- poprawnego złożenia wrzeciona mitotycznego;
- przyłączenia wszystkich chromosomów do wrzeciona mitotycznego w sposób dwubiegunowy;
- kongresji wszystkich chromosomów na płytce metafazowej.
Gdy tylko jeden chromosom (z jakiegokolwiek powodu) pozostaje opóźniony podczas kongresji, mechanizm wrzecionowego punktu kontrolnego generuje opóźnienie w progresji cyklu komórkowego: komórka zostaje zatrzymana, dając czas mechanizmom naprawczym na rozwiązanie wykrytego problemu. Po pewnym czasie, jeśli problem nie zostanie rozwiązany, komórka zostanie skierowana na apoptozę (programowaną śmierć komórki), mechanizm bezpieczeństwa pozwalający uniknąć generowania aneuploidii, sytuacji, która zazwyczaj ma dramatyczne konsekwencje dla organizmu.
Podczas gdy strukturalne białka centromerowe (takie jak CENP-B), pozostają stabilnie zlokalizowane w całej mitozie (w tym podczas telofazy), składniki wrzecionowego punktu kontrolnego są montowane na kinetochorze w wysokich stężeniach przy braku mikrotubul, a ich stężenia zmniejszają się wraz ze wzrostem liczby mikrotubul przyłączonych do kinetochoru.
W metafazie poziomy CENP-E, Bub3 i Bub1 zmniejszają się 3 do 4 razy w porównaniu z poziomami na kinetochorach niezaczepionych, podczas gdy poziomy dyneiny/dynaktyny, Mad1, Mad2 i BubR1 zmniejszają się >10-100 razy. Tak więc w metafazie, gdy wszystkie chromosomy są ustawione w jednej linii na płytce metafazowej, wszystkie białka punktu kontrolnego są uwalniane z kinetochoru. Zniknięcie białek punktu kontrolnego z kinetochorów wskazuje moment, w którym chromosom osiągnął płytkę metafazową i znajduje się pod napięciem bipolarnym. W tym momencie białka punktu kontrolnego, które wiążą się do i hamują Cdc20 (Mad1-Mad2 i BubR1), uwalniają Cdc20, który wiąże i aktywuje APC/CCdc20, a kompleks ten wyzwala rozdzielenie chromatyd siostrzanych i w konsekwencji wejście w anafazę.
Kilka badań wskazuje, że kompleks Ndc80 uczestniczy w regulacji stabilnej asocjacji Mad1-Mad2 i dyneiny z kinetochorami. Jednak białka związane z kinetochorami: CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H i BubR1 są niezależne od Ndc80/Hec1. Przedłużone zatrzymanie w prometafazie obserwowane w komórkach z niskim poziomem Ndc80/Hec1 zależy od Mad2, mimo że komórki te wykazują niski poziom Mad1, Mad2 i dyneiny na kinetochorach (<10-15% w stosunku do kinetochorów niezrzeszonych). Jednakże, jeśli zarówno poziom Ndc80/Hec1 jak i Nuf2 jest obniżony, Mad1 i Mad2 całkowicie znikają z kinetochorów, a punkt kontrolny wrzeciona jest nieaktywny.
Shugoshin (Sgo1, MEI-S332 w Drosophila melanogaster) są białkami centromerowymi, które są niezbędne do utrzymania kohezyny związanej z centromerami aż do anafazy. Ludzki homolog, hsSgo1, wiąże się z centromerami podczas profazy i zanika po rozpoczęciu anafazy. Kiedy poziom Shugoshin jest obniżony przez RNAi w komórkach HeLa, kohezyna nie może pozostać na centromerach podczas mitozy, a w konsekwencji chromatydy siostrzane rozdzielają się synchronicznie przed rozpoczęciem anafazy, co wywołuje długie zatrzymanie mitotyczne.
Z drugiej strony, Dasso i współpracownicy odkryli, że białka zaangażowane w cykl Ran mogą być wykryte na kinetochorach podczas mitozy: RanGAP1 (białko aktywujące GTPazę, które stymuluje konwersję Ran-GTP w Ran-GDP) oraz białko wiążące Ran zwane RanBP2/Nup358. Podczas interfazy białka te zlokalizowane s± przy porach j±drowych i uczestnicz± w transporcie j±drowo-cytoplazmatycznym. Lokalizacja kinetochorowa tych białek wydaje się być funkcjonalnie istotna, ponieważ niektóre zabiegi zwiększaj±ce poziom Ran-GTP hamuj± kinetochorowe uwalnianie Bub1, Bub3, Mad2 i CENP-E.
Orc2 (białko należące do kompleksu rozpoznawania pochodzenia -ORC- zaangażowanego w inicjację replikacji DNA w fazie S) jest również zlokalizowane w kinetochorach podczas mitozy w komórkach ludzkich; zgodnie z tą lokalizacją, niektóre badania wskazują, że Orc2 w drożdżach jest zaangażowany w kohezję chromatyd siostrzanych, a kiedy jest wyeliminowany z komórki, następuje aktywacja wrzecionowego punktu kontrolnego. Niektóre inne komponenty ORC (np. orc5 w S. pombe) również biorą udział w kohezji. Jednakże białka ORC wydają się uczestniczyć w molekularnym szlaku, który jest addytywny do szlaku kohezyny, i jest on w większości nieznany.
Wytwarzanie siły do napędzania ruchu chromosomówEdit
Większość ruchów chromosomów względem biegunów wrzeciona związana jest z wydłużaniem i skracaniem kMT. Jedną z najbardziej interesujących cech kinetochorów jest ich zdolność do modyfikowania stanu powiązanych z nimi kMT (około 20) ze stanu depolimeryzacji na ich (+) końcu do stanu polimeryzacji. Dzięki temu kinetochory komórek w prometafazie wykazuj± „niestabilno¶ć kierunkow±”, zmieniaj±c się pomiędzy trwałymi fazami ruchu w kierunku bieguna (poleward) lub w kierunku przeciwnym (anti-poleward), które s± sprzężone z naprzemiennymi stanami odpowiednio depolimeryzacji i polimeryzacji kMTs. Ta dwustabilno¶ć kinetochorowa wydaje się być czę¶ci± mechanizmu pozwalaj±cego na wyrównanie chromosomów na równiku wrzeciona bez utraty mechanicznego poł±czenia między kinetochorami a biegunami wrzeciona. Uważa się, że dwustabilno¶ć kinetochorów opiera się na dynamicznej niestabilno¶ci końca kMTs (+) i jest czę¶ciowo kontrolowana przez napięcie obecne w kinetochorach. W komórkach hodowlanych ssaków niskie napięcie kinetochorów promuje zmiany w kierunku depolimeryzacji kMTs, a wysokie napięcie promuje zmiany w kierunku polimeryzacji kMTs.
Białka kinetochorowe i białka wiążące się z MTs (+) koniec (wspólnie nazywane +TIPs) regulują ruch kinetochorów poprzez regulację dynamiki kMTs (+) koniec. Jednakże, interfejs kinetochor-mikrotubule jest wysoce dynamiczny, a niektóre z tych białek wydają się być bona fide komponentami obu struktur. Dwie grupy białek wydają się być szczególnie ważne: kinezyny, które działają jak depolimerazy, takie jak kinezyny KinI; oraz białka związane z końcami MT (+), +TIPs, promujące polimeryzację, być może antagonizujące efekt depolimerazy.
- Kininy KinI są nazwane „I”, ponieważ prezentują wewnętrzną domenę motoryczną, która wykorzystuje ATP do promowania depolimeryzacji polimeru tubuliny, mikrotubuli. U kręgowców najważniejsz± kinin± KinI kontroluj±c± dynamikę składania końca (+) jest MCAK. Wydaje się jednak, że istnieją również inne kinezyny, które są w to zaangażowane.
- Istnieją dwie grupy +TIPs z funkcjami kinetochorowymi.
- Pierwsza obejmuje białko adenomatous polyposis coli (APC) i związane z nim białko EB1, które potrzebują MTs do lokalizacji na kinetochorach. Oba białka są wymagane do prawidłowej segregacji chromosomów. EB1 wi±że się tylko do MTs w stanie polimeryzacji, co sugeruje, że promuje stabilizację kMTs podczas tej fazy.
- Druga grupa +TIPs obejmuje białka, które mog± lokalizować się na kinetochorach nawet przy braku MTs. W tej grupie znajdują się dwa białka, które zostały szeroko przebadane: CLIP-170 i związane z nimi białka CLASPs (CLIP-associated proteins). Rola CLIP-170 w kinetochorach jest nieznana, ale ekspresja dominuj±co ujemnego mutanta powoduje opóźnienie prometafazy, co sugeruje, że pełni ono aktywn± rolę w wyrównywaniu chromosomów. Białka CLASPs są wymagane do wyrównania chromosomów i utrzymania wrzeciona bipolarnego u Drosophila, ludzi i drożdży.
.