FilmEdit
Mastrantonio po raz pierwszy pojawiła się na ekranie w filmie Briana De Palmy Człowiek z blizną (1983) jako Gina, siostra Tony’ego Montany granego przez Ala Pacino. Sławę przyniosła jej nominowana do Oscara i Złotego Globu rola w filmie Kolor pieniędzy (1986), u boku Paula Newmana i Toma Cruise’a.
Inne role to Slam Dance (1987), u boku Toma Hulce’a, oraz The January Man (1989) z Kevinem Kline’em. Wystąpiła również w filmie science fiction Jamesa Camerona Otchłań (1989) u boku Eda Harrisa. W 1991 roku zagrała pokojówkę Marian w filmie Robin Hood: Książę złodziei u boku Kevina Costnera. Zagrała córkę adwokata postaci granej przez Gene’a Hackmana w Class Action, wystąpiła w thrillerze Consenting Adults (1992), a w Perfect Storm (2000) zagrała kapitana kutra rybackiego.
StageEdit
Mastrantonio występowała na Broadwayu w różnych musicalach, w tym w West Side Story, Copperfield, The Human Comedy, oraz w 2002 roku we wznowieniu Człowieka z La Manchy, w którym zagrała Aldonzę/Dulcyneę naprzeciwko Briana Stokesa Mitchella. Występowała w produkcjach New York Shakespeare Festival: Henryk V, Miarka za miarkę i Dwunasta noc. Jej występy na nowojorskiej scenie przyniosły jej nominację do nagrody Tony oraz dwie nominacje do nagrody Drama Desk Award.
Wystąpiła również w Grand Hotel w Donmar Warehouse na londyńskim West Endzie. W 1984 roku Mastrantonio wystąpiła w benefisowym przedstawieniu A Christmas Carol z Helen Hayes, Raulem Julią, Haroldem Scottem, F. MacIntyre Dixonem i Lenem Cariou w Symphony Space w Nowym Jorku. Na scenie, Mastrantonio wystąpiła ostatnio w A View from the Bridge jako Beatrice, u boku Kena Stotta i Allana Cordunera w Duke of York’s Theatre, Londyn.
Edycja telewizyjna
W 1991 roku, Mastrantonio pojawiła się jako Yelena w produkcji Wujaszka Wani w brytyjskim serialu antologicznym Performance.
Miała powracającą rolę podczas sezonów 4-5 (2005-2007) dramatu telewizyjnego Without a Trace.
Mastrantonio zagrała dowódcę jednostki kpt. Zoe Callas w sezonie 9 (2010) serialu Law & Order: Criminal Intent.
Począwszy od ostatniego odcinka Sezonu 1 (2012), Mastrantonio miała powracającą rolę w Grimm, grając Kelly Burkhardt, matkę bohatera serialu.
W 2013 roku wystąpiła gościnnie w Blue Bloods w odcinku „Inside Jobs”. Miała powracającą rolę w programie Hostages w latach 2013-14, grając Pierwszą Damę Mary Kincaid.
W 2015 roku została obsadzona w głównej roli w Limitless na CBS, grając agentkę specjalną FBI Nasreen „Naz” Pouran, która zadebiutowała 22 września 2015 roku.
W 2017 roku wystąpiła gościnnie w roli Marion James, zastępcy dyrektora Centralnej Agencji Wywiadowczej, w trzech odcinkach Marvel’s The Punisher na Netflix.
Od 2018 do 2020 roku występowała jako Madeline Burke w dramacie akcji NBC Blindspot.
W latach 2018-2020 wcieliła się w rolę Madeline Burke w dramacie akcji NBC.