METODY
Jest to badanie przekrojowe przeprowadzone w celu oceny statusu ABH secretor i non- secretor w populacji Karachi (Pakistan). Do badania wybrano losowo stu jeden zdrowych dorosłych studentów (76 mężczyzn, 25 kobiet) w wieku od 15 do 40 lat. Od wszystkich osób uzyskano pisemną, świadomą zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Baqai Medical University, Karachi. Od wszystkich osób pobrano 10 ml śliny do wysterylizowanych plastikowych pojemników jednorazowego użytku. Pięć ml (2 ml w probówce z EDTA i 3 ml w probówce bez antykoagulacji) krwi pobrano aseptycznie od wszystkich osób w celu oznaczenia grupy komórek i surowicy.
Przygotowanie 3% zawiesiny krwinek czerwonych: Dwa ml krwi pobranej do probówki z antykoagulantem EDTA odwirowywano przy niskiej prędkości (1500 obr./min) przez 3 minuty. Osocze przenoszono do innej probówki i używano do oznaczania grup surowicy. Probówkę z komórkami napełniano zwykłym roztworem soli fizjologicznej. Probówkę dobrze wymieszano i ponownie odwirowano przy 1500 obr/min przez 3 minuty. Procedurę płukania powtórzono dwukrotnie. Podczas ostatniego płukania probówkę odwirowywano z dużą prędkością (3000 obr./min) przez 3 minuty, a supernatant odrzucano. Przezroczysty supernatant i pojawienie się linii wleczonej wskazuje na prawidłowe płukanie komórek.
I: Grupowanie komórek: Trzy czyste szklane probówki zostały oznaczone jako probówka A dla anty A, probówka B dla anty B i probówka D dla anty D. Jedna kropla surowicy odpornościowej została dodana jako surowica anty A do probówki A, surowica anty B do probówki B i surowica anty D do probówki D. Jedna kropla 3% zawiesiny krwinek czerwonych została dodana do probówki A, probówki B i probówki D. Cała zawartość została dobrze wymieszana. Wszystkie probówki zostały natychmiast odwirowane przez wyważanie przy 3400 obr/min przez 15 sekund. Wszystkie probówki wyjęto delikatnie i zbadano indywidualnie pod kątem aglutynacji.
II: Grupowanie surowicy: Surowicę oddzielono od probówki bez antykoagulacji po odwirowaniu przez 5 minut przy 3000rmp. Trzy czyste szklane probówki zostały oznaczone jako probówka „a” dla komórek A, probówka „b” dla komórek B i „o” dla komórek O. Do każdej probówki dodano dwie krople surowicy osobniczej. Do probówek „a”, „b” i „o” dodawano po jednej kropli znanej 3% zawiesiny krwinek czerwonych A, B i O. Zawartość wszystkich probówek dobrze wymieszano i natychmiast odwirowano przez 15 sekund. Wszystkie probówki zostały delikatnie wyjęte, a probówkę zbadano indywidualnie pod kątem aglutynacji.
Wszystkie próbki badano w ciągu 6 godzin, używając świeżej zawiesiny krwinek czerwonych tej samej osoby. Zbieranie i przetwarzanie śliny: Dziesięć ml śliny pobrano od wszystkich osób do sterylizowanego plastikowego pojemnika jednorazowego użytku i przeniesiono z pojemnika do sterylizowanej szklanej probówki jednorazowego użytku. Probówkę zawierającą ślinę odwirowywano przy 2000 obr/min przez 10 minut. Supernatant przenoszono do innej szklanej probówki. Probówkę z supernatantem umieszczono w łaźni wodnej w temperaturze 56oC na 30 minut w celu inaktywacji amylazy ślinowej. Probówkę z próbką schłodzono i ponownie odwirowano przez 10 minut przy 2000 rpm. Supernatant przenoszono do innej probówki jednorazowego użytku i używano do testu zahamowania hemaglutynacji lub neutralizacji.
Zasada testu zahamowania hemaglutynacji: Substancje ABH obecne w formie rozpuszczalnej w płynach (np. ślinie) neutralizują odpowiadające im przeciwciała. Przeciwciała nie będą już w stanie aglutynować krwinek czerwonych posiadających te same antygeny.11,12
Procedura testu zahamowania hemaglutynacji:
Przygotowanie rozcieńczeń podwajających antysurowice grup krwi: Dziesięć probówek testowych umieszczono w stojaku oznaczonym zgodnie z mianem tj. 1:2 (probówka1), 1:4 (probówka2), do 1:1024 (probówka10). Do wszystkich probówek dodano dwieście mikrolitrów soli fizjologicznej. Do probówki nr 1 dodano 200 µl antysurowicy i dobrze wymieszano. Dwieście µl rozcieńczeń z probówki1 przeniesiono do probówki2 i dobrze wymieszano. Tę samą procedurę powtórzono od probówki nr 2 do probówki nr 10. Dwieście µl rozcieńczonej antysurowicy wyrzucano z probówki10. Każda probówka zawierała równą ilość antysurowicy i soli fizjologicznej. Ten roztwór podwojonego rozcieńczenia został użyty w teście hamowania aglutynacji hemowej.
Trzy rzędy po 10 probówek umieszczono w stojaku i oznaczono jako; I: Probówki do podwojenia rozcieńczenia (D/D) II: Probówki kontrolne (Titration tubes) III: Probówki testowe (Inhibition tubes).
Podwójne rozcieńczenie antysurowic specyficznych dla danej grupy krwi przygotowano w rzędzie I. Każda probówka była oznaczona zgodnie z mianem tj. 1:2 (probówka1), 1:4 (probówka2) do 1:1024 (probówka10). Sto µl antysurowicy specyficznej dla grupy krwi w każdym rozcieńczeniu przeniesiono do odpowiednio oznakowanych probówek w rzędzie II i III, jak pokazano w tabeli I. Do każdej probówki w rzędzie II dodano po sto µl soli fizjologicznej. Do każdej probówki w rzędzie III dodano sto µl śliny. Wszystkie probówki z rzędów II i III zostały zakręcone i dobrze wymieszane. Probówki inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut w łaźni wodnej z okresowym wstrząsaniem. Po inkubacji do każdej probówki w rzędzie II i III dodano 100 µl 3% zawiesiny krwinek czerwonych specyficznych dla danej grupy i dobrze wymieszano. Wszystkie probówki inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Wszystkie probówki obserwowano pod kątem aglutynacji makroskopowo przy dobrym oświetleniu.
Interpretacja wyników:
-
Stan sekrecji pozytywnej:
Aglutynacja makroskopowa przy wyższym mianie (1:128) w kontroli (rząd II) i niższym mianie (1:16) w teście (rząd III) wskazywała na obecność substancji z grupy krwi w badanej ślinie.
-
Status ujemnego sekretarza:
Brak różnicy w mianie, przy którym widoczna była aglutynacja w obu rzędach, sugerował brak w ślinie substancji specyficznych dla grupy krwi, które neutralizowałyby surowicę.13
Analiza statystyczna: Do analizy danych wykorzystano pakiet statystyczny dla nauk społecznych (SPSS) wersja 17. Do obliczenia częstości i odsetków wykorzystano statystykę opisową.