Budowa systemu
Gdy obcy cel przekroczy próg tolerancji immunologicznej, humoralne i komórkowe składniki układu odpornościowego kręgowców zostają wezwane do działania. Kluczową funkcją jest prezentacja antygenów, która zapewnia mechanizm rozpoznawania i odpowiedzi. Komórki B wydzielają przeciwciała, które wiążą się z antygenem i oznaczają go, podczas gdy komórki T atakują komórki docelowe. Zarówno limfocyty T, jak i B odgrywają również rolę w tworzeniu komórek pamięci. Jak pokazano na ryc. 1, podzieliliśmy tę serię zdarzeń na trzy etapy (rozpoznanie i tolerancja, odpowiedź immunologiczna oraz zabijanie i pamięć) pod kontrolą czterech funkcjonalnych komponentów DNA, w tym dupleksów DNA AM (naśladowanie komórek prezentujących antygen (APC)), BM (naśladowanie komórek B), PG (generator primerów, który generuje startery dla przeciwciała analogowego) i jednoniciowy kolisty DNA CT (kolisty szablon, który kontroluje sekwencję przeciwciała analogowego), jak również dwa enzymy (polimeraza DNA Phi29 i enzym restrykcyjny SspI) zdolne do autonomicznej i programowej odpowiedzi na przychodzący fragment jednoniciowego DNA (ssDNA) patogenu (P0) pobrany z genomu bakterii. Gdy P0 nie jest obecny, system jest utrzymywany w stałym, zrównoważonym stanie przez efektywne blokowanie domen funkcjonalnych w każdym komponencie. Jednakże, gdy P0 stanowi wyzwanie, te funkcjonalne domeny są aktywowane w serii kroków zaprojektowanych tak, aby naśladować trzy etapy podane powyżej.
AIRS składa się z trzech kroków: (1) rozpoznanie i tolerancja, (2) odpowiedź immunologiczna oraz (3) zabijanie i pamięć. Funkcje te są zablokowane przy braku ssDNA patogenu (P0), ale gdy P0 zostanie wprowadzony do systemu AIRS, jest on napędzany przez serię reakcji przemieszczania nici DNA i reakcji DNA-enzymów. Kolorowe słupki wskazują nici DNA z różnymi domenami. Wszystkie domeny x są komplementarne do x*; P0 jest sekwencją patogenu, która posiada zdolność infekcyjną w formie ssDNA. AM (antigen-presenting cell mimicry), BM (B-cell mimicry) i PG (primer generator, który generuje primery dla analogowego przeciwciała) są początkowo obecne jako komponenty dupleksowe, wraz z CT (circular template, który kontroluje sekwencję analogowego przeciwciała) i dwoma funkcjonalnymi enzymami, polimerazą Phi29 i enzymem restrykcyjnym SspI. TM (T Cell Mimicry); RCA (rolling cycle amplification). P1 i P2 są produktami reakcji wypierania.
W etapie 1, przy braku P0, funkcjonalne składniki układu pozostają w stazie. Naśladując tolerancję immunologiczną, niereagujący stan obrony immunologicznej, priorytet reakcji P0 na dupleksowe DNA AM, jak również na BM, jest kontrolowany poprzez długości odpowiadających im toeholds, które są krótkimi segmentami ssDNA overhang w dupleksach. Odpowiednio, zaprojektowaliśmy 10 nukleotydowe (nt) toehold w AM z szybkością reakcji przemieszczania k wynoszącą 106 M-1 s-1 i 0 nt toehold w BM z wartością k wynoszącą 103 M-1 s-1 dla początkowej hybrydyzacji P017,18. AM może wykazywać P0, który ma dwie domeny ssDNA, jedną posiadającą sekwencję zaczerpniętą z genomu Bacillus anthracis, Gram-dodatniej bakterii o kształcie pręcika (P), a drugą zaprojektowaną (domena ssDNA 2-3-4) do kontrolowania dalszych reakcji poprzez reakcję wypierania DNA. Jednakże, w fazie rozpoznania i tolerancji, nasz system może przejść do kroku 2, odpowiedzi immunologicznej, tylko wtedy, gdy ilość nagromadzonego patogenu przekroczy próg AM.
Po osiągnięciu progu tolerancji immunologicznej w systemie, aktywowany jest krok 2, analogowa humoralna odpowiedź immunologiczna. Jak wcześniej zauważono, podczas wyczerpywania AM przez reakcję wypierania, gromadzi się jeden z produktów wypierania, ssDNA TM (naśladowca komórek T), który może być użyty jako katalizator do zwiększenia szybkości reakcji między P0 i BM, a tym samym uwolnienia primera (domena ssDNA 12a) dla katalizowanej przez polimerazę DNA amplifikacji w kręgu tocznym (RCA), którą ten system zastosuje do wytworzenia DNA naśladującego „przeciwciało” (P*) do antygenu B. anthracis (P). Tak więc, aby odtworzyć odpowiedź immunologiczną obrony gospodarza, włączyliśmy dwa fragmenty sekwencji genomowej B. anthracis (P) do CT, co spowodowało szybkie wytworzenie komplementarnych sekwencji P*, zasadniczo przez amplifikację enzymatyczną, przy użyciu polimerazy DNA Phi29, replikującej polimerazy z faga B. subtilis phi29, i trifosforanu dezoksyrybonukleotydu (dNTP), aby naśladować szybkie i specyficzne dla przeciwciał wytwarzanie naturalnie produkowane przez komórki B.
W kroku 3, zabijanie i pamięć, proponowanego systemu konieczne było naśladowanie procesu, w którym komórkowa odpowiedź immunologiczna eliminuje patogeny po wytworzeniu kompleksu przeciwciało-antygen z organizmu, co, jak zauważono powyżej, wynika z aktywacji humoralnej odpowiedzi immunologicznej przez limfocyty B. Aby to osiągnąć, konieczne było zastosowanie trzech rodzajów infekcji. Aby to osiągnąć, przyjęto trzy stany zakaźne: pierwotną nić patogenu P0 oraz produkty reakcji wypierania (z AM i BM) P1 i P2. Wszystkie one razem zawierają domenę patogenu zakaźnego (P). Następnie, w celu utworzenia kompleksu przeciwciało-antygen w układzie, domena P w P0, P1 i P2 hybrydyzuje z dużą ilością P* i tworzy stabilne regiony dupleksowe PP*. Jednakże, chociaż układ odpornościowy gospodarza kręgowców wykorzystuje fagocytozę jako kluczową strategię usuwania patogenów, zaprojektowaliśmy czysto biomechaniczną metodę naśladowania aktywacji humoralnej odpowiedzi immunologicznej, czyli wiązania pomiędzy wytworzonym P* i domeną P patogenu, po którym następuje etap oparty na enzymach restrykcyjnych, który naśladuje zabijanie przez komórki poprzez specyficzne cięcie dupleksu „przeciwciało-antygen”. Bardziej szczegółowo, ten ostatni etap jest osiągany, gdy hybrydyzacja domeny P z P* tworzy aktywne miejsce rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego SspI, który jest ekstrahowany ze szczepu E. coli, który przenosi sklonowany i zmodyfikowany (Y98F) gen sspi z miejsca restrykcyjnego gatunków Sphaerotilus. W ten sposób domena P w P0, P1 i P2 może zostać specyficznie przecięta na dwa fragmenty o numerach nukleotydów 56 i 15 (ref. 19), tracąc w ten sposób infekcyjność.
Następnie, w adaptacyjnym układzie odpornościowym, niektóre komórki T i B staną się komórkami pamięci zdolnymi do „zapamiętania” specyficznych patogenów. Te komórki pamięci będą wyzwalać znacznie szybszą odpowiedź immunologiczną przy kolejnym kontakcie z tym samym patogenem. Dlatego, aby stworzyć mechanizm naśladujący funkcję pamięci komórek B, zwróciliśmy się do ssDNA TM, który jest wytwarzany w reakcji przemieszczenia pomiędzy P0 i AM i pozostaje w układzie od pierwszej ekspozycji na P0. Opisujemy również jego katalizę przemieszczenia P0 i BM w celu szybkiego uwolnienia primera, a tym samym uruchomienia szybszej reakcji RCA, która tworzy przeciwciała dla następnej ekspozycji na tę samą sekwencję patogenu. Reakcja ta jest określana jako napędzana entropią, ponieważ jest to reakcja, która spontanicznie ewoluuje w kierunku równowagi termodynamicznej (Suplementarne Rys. 7)18. Bez TM, szybkość przemieszczania się pomiędzy P0 i BM byłaby spowolniona przez efektywne blokowanie aktywnych domen na BM. Jednakże, w obecności TM, BM może hybrydyzować z TM poprzez swoje 4 nt toehold (domena 5*), a następnie uwolnić inicjator primera ssDNA (PI) i produkt uboczny W1, co skutkuje powstaniem nowego regionu wiążącego toehold (domena 3*) dla hybrydyzacji pomiędzy P0 i BM, która jest napędzana termodynamicznie do przodu przez zysk entropowy uwolnionych cząsteczek. Tak więc efekt pamięci jest wytwarzany poprzez przyspieszenie tempa reakcji pomiędzy P0 i BM wykorzystując katalityczny efekt pozostałej TM powstałej w wyniku początkowego rozpoznania. W ten sposób, poprzez pozostawienie TM jako „paliwa katalitycznego” w układzie, uzyskuje się efekt pamięci dla określonego wejścia patogenu.
Weryfikacja transdukcji sygnału
Aby zapewnić prawidłowe działanie całej sieci, transdukcja sygnału na każdym etapie była walidowana oddzielnie. Aby zbadać precyzję funkcji progowej AM, użyliśmy metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) do badania kolejności hybrydyzacji P0 z AM i BM. Para fluoroforów (fluoresceina (FAM)) i wygaszacz (DABCYL (DAB)) została sprzężona w dupleksie PG, aby wskazać uwolnioną ilość primera dla reakcji RCA. Przywrócenie fluorescencji następuje tylko wtedy, gdy przekroczony zostanie progowy poziom AM, po czym reakcja przechodzi do etapu 2, reakcji immunologicznej, opartej na reakcjach przemieszczenia nici, które mogą uwolnić nić primera znakowaną przez kwenchery. Dlatego też, w obecności 80 nM AM, 100 nM BM i 100 nM fluoroforu/kwenchera znakowanego PG, wprowadzono do układu różne stężenia P0 (od 0 do 150 nM) z monitorowaniem fluorescencji przy 517 nm. Jak pokazano na Rys. 2b, odbudowa fluorescencji wykazywała gwałtowny wzrost przy stężeniu P0 wynoszącym 80 nM, ale niewielki wzrost poniżej 80 nM, co wskazuje, że reakcja pomiędzy P0 i BM rozpoczęła się w punkcie zubożenia AM. Innymi słowy, wartość progowa AM do P0 jest regulowana przez zmianę stężenia AM. W tym przypadku, punkt wyczerpania, lub poziom progowy, AM został osiągnięty przy 80 nM, wskazując, że reakcja pomiędzy P0 i BM mogła zapoczątkować etap 2, który u ludzi jest produkcją przeciwciał przez limfocyty B. Aby dodatkowo potwierdzić ten wynik, monitorowano kinetykę fluorescencji powyższego układu. Początkowo w buforze zmieszano 80 nM AM, 100 nM BM i 100 nM PG, a następnie dodano niewielką ilość P0 (30 nM). W wyniku nadmiaru AM i jego pierwszeństwa reakcji do P0 przez wymagania kroku 1, wystąpiła powolna kinetyka odbudowy fluorescencji. Jednakże, gdy do układu dodawano w sposób ciągły kolejne porcje P0 (każdorazowo 30 nM), obserwowano gwałtowny wzrost (łącznie po 90 nM) kinetyki fluorescencji, co wskazuje, że reakcja może przejść do etapu 2. Testowano różne wartości progowe poprzez zmianę stężeń AM i BM (Rys. 1 uzupełniający). Do wskazania kolejności reakcji wykorzystano również elektroforezę żelową (Supplementary Fig. 2). Ponieważ ta sama domena rozpoznawcza (2-3-4) jest wspólna, podobne wyniki eksperymentalne obserwowano również zastępując P0 inną sekwencją patogenu, P0-SARS (genomowy DNA koronawirusa zespołu ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej) (Supplementary Fig. 3). Wszystkie testy potwierdziły efektywną funkcję progową AM w stosunku do reakcji pomiędzy BM i P0, a tym samym zapewniły makroskopową imitację stanu „rozpoznania i tolerancji” AIS.
a, Schemat etapów reakcji zachodzących w etapach 1 i 2. W2 jest produktem ubocznym reakcji wypierania PI i PG. b, Wykres odbudowy fluorescencji układu z 80 nM AM, 100 nM BM i 100 nM PG znakowanego FAM/DAB z różnymi stężeniami patogenu ssDNA P0. c, Eksperymenty kinetyki układu z 80 nM AM, 100 nM BM i 100 nM PG znakowanego FAM/DAB. W każdym punkcie czasowym do buforu dodawano osobno 30 nM P0. d, Eksperymenty kinetyczne badające katalityczny efekt TM. Czarna krzywa przedstawia kinetykę tła z 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM PG znakowanego FAM/DAB i bez P0. Czerwona krzywa przedstawia kinetykę niekatalizowanej reakcji z 100 nM BM, 100 nM PG znakowanego FAM/DAB i 150 nM P0. Niebieska krzywa przedstawia kinetykę reakcji katalizowanej z 80 nM AM, 100 nM BM, 100 nM PG znakowanego FAM/DAB i 150 nM P0. Eksperymenty przeprowadzono w temperaturze 25 °C w 50 mM buforze Tris-HCl, który zawierał 10 mM MgCl2. a.u., jednostki arbitralne.
Kolejną istotną funkcją AM jest wytwarzanie katalitycznego ssDNA TM ułatwiającego reakcję hybrydyzacji pomiędzy P0 i BM, co według Zhanga i wsp.18, ssDNA TM jest nie tylko ważny w ułatwianiu hybrydyzacji między P0 i BM, ale jest również kluczem do tworzenia „mimetycznych komórek pamięci”. Dlatego, aby udowodnić katalityczny efekt TM, nadal używaliśmy naszego modelu raportowania opartego na FRET, jak opisano powyżej. Odpowiednio, 80 nM AM, 100 nM BM i 100 nM PG znakowanych FAM/DAB inkubowano w buforze. Następnie do układu dodawano 150 nM P0. Użyliśmy nadmiarowej ilości P0 do AM, aby pokonać wartość progową. TM jest generowana w kroku 1 jako rezultat reakcji pomiędzy P0 i AM. Tak więc, P0, gdy przekroczy wartość progową (ustawioną przez kontrolowanie stężenia AM), z kolei powoduje reakcję katalityczną pomiędzy nadmiarem P0 i TM przez entropię, która może szybko przywrócić fluorescencję układu. Dla porównania, to samo stężenie P0 zostało dodane bezpośrednio do roztworu zawierającego 100 nM BM i 100 nM PG znakowanego FAM/DAB, ale bez AM. Jak pokazano na Rys. 2d, pomiary kinetyki fluorescencji reakcji katalizowanej wykazały ponad 500-krotne przyspieszenie w porównaniu z reakcją bez katalizy18,20. Tak więc, jak wyjaśniono powyżej, uwolniona TM może służyć jako specyficzna mimikra pamięciowa, co skutkuje silniejszą i szybszą odpowiedzią immunologiczną w przypadku następnej ekspozycji na ten sam patogen. Następnie potwierdziliśmy również, że ilość P* wytworzona z enzymatycznej amplifikacji do hybrydyzacji z domeną P w P0, P1 i P2 może być określona przez ilość primera, dzięki czemu reakcja enzymatyczna może być kontrolowana przez reakcje upstream w krokach 1 i 2 (patrz Informacje uzupełniające). Ponadto, zbadano trawienie oparte na enzymach restrykcyjnych wygenerowanego kompleksu antygen-przeciwciało, co zostało przedstawione w Informacjach Dodatkowych.
Wykonanie całego systemu
Po potwierdzeniu prawidłowego działania każdego z etapów, przetestowaliśmy dalej działanie całego systemu z tym samym wejściem nici patogenu z genomu B. anthracis (P0). Aby potwierdzić tolerancję AIRS, do układu dodano niewielką ilość P0 (100 nM) i monitorowano fluorescencję w czasie rzeczywistym. Następnie, zaprojektowaliśmy molekularną latarnię DNA (MB-R) do fluorescencyjnego raportowania ilości produktu RCA, używając sekwencji genomowej P patogenu B. anthracis jako pętli. MB-R może być otwierany przez produkty RCA, czyli P*, i w ten sposób wykazywać odbudowę fluorescencji, która reprezentuje różne ilości P*. Figura 3a pokazuje, że kinetyka fluorescencji jest podobna do tej bez P0, co potwierdza, że system nie jest aktywowany do wytwarzania P*, gdy ilość patogenu jest poniżej poziomu tolerancji immunologicznej (to jest progu 200 nM). Jednakże, gdy do układu dodano kolejne 150 nM P0 w celu naśladowania drugiej ekspozycji na ten sam patogen, odtworzenie fluorescencji wykazało znacznie szybsze zachowanie kinetyki, co wskazuje na produkcję dużej ilości P* i udane wyzwolenie odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, szybsza odpowiedź podczas drugiej ekspozycji również potwierdza efekt pamięci tego systemu dla konkretnego patogenu. Jeśli jako wejścia patogenu użyto P0-SARS, a jako reportera użyto molekularnego beaconu zakodowanego z P0-SARS (MB-R-SARS), zaobserwowano podobne trendy fluorescencji-odpowiedzi, jak pokazano na Rys. 3b, co wskazuje, że AIRS potencjalnie działa dla drugiego wejścia patogenu. Użyliśmy również innego systemu raportowania fluorescencji, aby wskazać ilość wygenerowanego P*, który jest pokazany na Rys. 10.
a,b, Kinetykę fluorescencji generacji mimikry przeciwciał P*(P*-SARS) monitorowano przy różnych stężeniach P0 (a) i P0-SARS (b). Tutaj użyliśmy podwójnych ilości poszczególnych składników DNA w porównaniu z tymi użytymi do danych przedstawionych na Fig. 2, aby zapewnić, że stężenia były zgodne z eksperymentem żelowym.
Używając reportera fluorescencji w niezależnych eksperymentach, wykazano, że AIRS działa równie dobrze z dwoma różnymi wejściami patogenów. Dlatego następnie zbadaliśmy, czy może on również działać, gdy dwa różne wejścia były prezentowane jednocześnie. Aby to ustalić, P0 i P0-SARS zostały wprowadzone razem do roztworu, który zawierał wszystkie składniki (300 nM AM, 300 nM BM, 300 nM PG, 50 nM CT-P0, 50 nM CT-P-SARS, 0.5 U μl-1 Phi29 i 250 μM dNTP). Podobnie jak w powyższym eksperymencie, do mieszaniny dodano również dwa różne beacony molekularne z tym samym fluoroforem i wygaszaczem (MB-R i MB-R-SARS), aby fluorescencyjnie raportować ilości obu produktów RCA, czyli P* i P*-SARS. Jak pokazano na Rys. 14, tak długo, jak stężenie obu patogenów jest poniżej poziomu tolerancji immunologicznej (próg 300 nM), AIRS nie jest aktywowany i fluorescencja pozostaje niezmieniona w porównaniu z sygnałem tła. Jednakże, kiedy stężenia wzrastają do poziomu wyższego niż próg dla jednego lub obu patogenów, fluorescencja zostaje przywrócona, co wskazuje, że oba wejścia patogenów mogą generować odpowiednią mimikrę przeciwciał, kiedy są zmieszane razem. Potwierdza to, że AIRS ma zdolność do jednoczesnej odpowiedzi na dwa różne patogeny.
Aby dokładniej scharakteryzować bezbłędne działanie systemu AIRS, użyliśmy elektroforezy żelowej do analizy końcowej ilości P*. Jak pokazano na Rys. 4a, tylko jedno ostre pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej może być widoczne, gdy ilość patogenu przekracza poziom progowy (100 + 150 nM), co jest zgodne z poprzednimi wynikami fluorescencji. Aby zbadać wiązanie pomiędzy wejściową nicią patogenu (P0) a nicią naśladującą przeciwciało (P*) w kroku 3, zmodyfikowaliśmy P0 fluoroforem (FAM). Po wygenerowaniu P*, hybrydyzacja pomiędzy P0 i P* została potwierdzona, jako że pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej mogło być widoczne w kanale obrazowania izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (Supplementary Fig. 13). Po dodaniu do systemu większej ilości znakowanego FAM P0 (od jednego do 250 nadmiarów), hybrydyzacja pomiędzy nadmiarem P0 i generowanym P* była nadal obserwowana, co wskazuje, że AIRS mógł wystarczająco związać nadmiar wejściowej nici patogenu (P0) przez RCA. Wreszcie, inkubowaliśmy enzym restrykcyjny (2 U µl-1) wraz z pozostałymi składnikami (200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0,5 U µl-1 Phi29 i 250 µM dNTP). Po wprowadzeniu nadmiernego stężenia P0 znakowanego FAM (500 nM), aby przekroczyć tolerancję immunologiczną układu, pod kanałem FITC wykryto pasmo fragmentu trawienia z modyfikacją FAM (56 nt), co pozwala wnioskować, że patogen został skutecznie (Rys. 4b) strawiony. Co ciekawe, jeśli P0 zostanie zastąpiony wejściem z polimorfizmem podwójnego nukleotydu (P0-mis), mimikra przeciwciała P* może być nadal generowana z nadmiarem stężenia P0-mis. Jednak hybrydyzacja między P0-mis i P* nie może być trawiona przez enzym restrykcyjny SspI, co pokazuje, że system AIRS jest wrażliwy na rozpoznawanie polimorfizmu nukleotydów wejścia patogenu (Supplementary Fig. 11). AIRS został zaprojektowany z dwoma warstwami selektywności, co umożliwia systemowi odróżnienie P0 od wejścia z podwójnym polimorfizmem nukleotydów, P0-mis. Wyjaśniamy, że relatywnie słabsza zdolność wiązania pomiędzy P0-mis i P* w porównaniu z tą pomiędzy P0 i P* sprawia, że dupleks P0-mis-P* jest mniej stabilny. Dodatkowo, niedopasowany dupleks P0-mis-P* nie może utworzyć efektywnego miejsca wiążącego z enzymem restrykcyjnym SspI (AAT-ATT), a tym samym zmniejszyć szybkości trawienia enzymu, co z kolei skutkuje znacznie mniejszą ilością produktu rozszczepienia z wejściowego P0-mis (Suplementarna Fig. 11). W przeciwieństwie do tego, ponieważ hybrydyzacja P0-SARS z P* tworzy miejsce wiązania rozpoznania identyczne z miejscem wiązania enzymu restrykcyjnego SspI, uzyskano podobne wyniki elektroforezy żelowej (Rys. 4c), co ponownie potwierdza, że AIRS może działać dla różnych danych wejściowych patogenów.
a, Analiza generacji przeciwciał naśladujących P* za pomocą żelu agarozowego (1,5%). L, drabinka 100-base-pair. Obraz wykonano w kanale obrazowania bromku etydyny (EB) (λekscytacja = 520 nm, λemisja = 605 nm). b, Walidacja wydajności systemu analogowego AIRS z nicią patogenną P0 przez żel agarozowy (1%). M jest mieszaniną oryginalnych składników obecnych w AIRS. Tutaj M = mieszanina 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT, 0.5 U µl-1 Phi29 i 250 µM dNTP; czas inkubacji, jedna godzina. Pasek 1, M + 0 nM FAM-etykietowany P0; pasek 2, M + 100 nM FAM-etykietowany P0; pasek 3, M + 500 nM FAM-etykietowany P0; pasek 4, M + 100 nM FAM-etykietowany P0 + 2 U µl-1 SspI; pasek 5, M + 500 nM FAM-etykietowany P0 + 2 U µl-1 SspI; L, drabinka 1 kb. c, Walidacja wydajności systemu analogowego AIRS z nicią patogenu P0-SARS za pomocą żelu agarozowego (1%). M = mieszanina 200 nM AM, 200 nM BM, 200 nM PG, 50 nM CT-SARS, 0,5 U µl-1 Phi29 i 250 µM dNTP; czas inkubacji, jedna godzina. Pas 1, M + 0 nM FAM-etykietowany P0-SARS; pas 2, M + 100 nM FAM-etykietowany P0-SARS; pas 3, M + 500 nM FAM-etykietowany P0-SARS; pas 4, M + 100 nM FAM-etykietowany P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; pas 5, M + 500 nM FAM-etykietowany P0-SARS + 2 U µl-1 SspI; L, drabinka 1 kb.
Wreszcie, jak zauważono powyżej, specyficzność systemu zależy głównie od enzymu restrykcyjnego i sekwencji CT (patrz Informacje uzupełniające). Kiedy zakwestionowaliśmy system wprowadzając znakowany FAM P0-SARS jako patogenny wkład, ale CT dla B. anthracis jako szablon amplifikacji, nie pojawiło się oczywiste fluorescencyjne pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej ani z małą ani z dużą ilością P0-SARS pod kanałem FITC z powodu braku hybrydyzacji pomiędzy P0-SARS i P* specyficznie wygenerowanym dla B. anthracis (Supplementary Fig. 12).