(Bio)degradation Pathways of Nitroaromatic Explosives
TNT, który ma dodatnie Θzz, ulega głównie nukleofilowym, redukcyjnym (bio)przemianom ze względu na elektrofilowy charakter jądra aromatycznego i atomu N grupy nitrowej (Stenuit i Agathos, 2010). Frakcjonowanie izotopów C, N i H związków nitroaromatycznych w materiałach podpowierzchniowych potwierdziło, że TNT ulega głównie przemianom redukcyjnym, podczas gdy przemiany 2,4-DNT, który charakteryzuje się wyższą gęstością elektronową niż TNT, zachodzą głównie w wyniku utleniania (Wijker i in., 2013).
W konsekwencji TNT łatwo ulega redukcji do nitrozo, hydroksyloamino i ostatecznie aminoaromatycznych pochodnych poprzez trzy kolejne przeniesienia pary elektronowej (Stenuit i Agathos, 2010). Początkowy, czteroelektronowy etap nitroredukcji jest katalizowany przez typowe, zależne od NAD(P)H, niewrażliwe na tlen (typ I) nitroreduktazy (Stenuit i Agathos, 2010) oraz transferazy wodorkowe typu I i typu II z rodziny Old Yellow Enzyme (OYE) (van Dillewijn i in., 2008). Sugeruje się, że inne enzymy mogą być dalej zaangażowane w ostatni dwuelektronowy etap nitroredukcji w celu utworzenia aminoreduktora (Riefler i Smets, 2002).
Dodatkowo, TNT nie podlega konwencjonalnemu atakowi elektrofilowemu przez oksygenazy. Odwrotnie, TNT jest podatny na napędzany przez nadtlenki atak nukleofilowy, jak to zaobserwowano w przypadku układu biomimetycznego zawierającego zredukowane nukleotydy pirydyniowe i piocjaninę, redoks-aktywny metabolit wydzielany przez Pseudomonas aeruginosa (Stenuit i in., 2009, Stenuit i in., 2012). Ponadto, anionowe σ-addukty TNT, określane również jako kompleksy TNT Meisenheimera, łatwo powstają w wyniku tworzenia wiązań kowalencyjnych pomiędzy nukleofilami, takimi jak ujemnie naładowana forma atomu wodoru, H- (jon wodorkowy), a pierścieniem aromatycznym TNT. Do tej pory scharakteryzowano kilka enzymów pochodzących z bakterii i roślin, które katalizują nukleofilową addycję jonów wodorkowych do pierścienia aromatycznego TNT, w tym specyficzne NAD(P)H-zależne transferazy wodorkowe typu II OYE (Rysunek 3(a)) (Beynon i in., 2009, Durchschein i in., 2013) oraz, w znacznie mniejszym stopniu, specyficzne, zależne od F420 aktynomycetalne transferazy wodorkowe (Heiss i Knackmuss, 2002). Po przeniesieniu jonów wodorkowych do pierścienia aromatycznego TNT powstają wodorkowe i dwuwodorkowe Meisenheimerowskie kompleksy TNT (odpowiednio -TNT i -TNT), które mogą dalej dawać azotyny i różnorodne denitrowane metabolity TNT, które zwykle gromadzą się w medium reakcyjnym. Dlatego też, nawet jeśli azot z TNT może być dalej asymilowany poprzez aktywność reduktazy azotynowej i szlaku syntetazy glutaminowej – syntazy glutaminianowej (GS-GOGAT), powszechnie obserwuje się, że zdenitrowane metabolity TNT nie mogą być wykorzystane jako źródło węgla. Nieodłącznym problemem są rozległe chemiczne i metaboliczne pomyłki, które uniemożliwiają powstanie unikalnej, korzystnej ścieżki biodegradacji TNT. Na przykład, produkty kondensacji metabolitów TNT mogą być wytwarzane pomiędzy (i) izomerami nitrozo- i hydroksyloamino-dinitrotoluenu, tworząc związki tetranitroazoksytoluenowe, takie jak 4,4′,6,6′-tetranitro-2,2′-azoksytoluen oraz (ii) izomerami hydroksyloamino-dinitrotoluenu i protonowanymi dwuwodnymi kompleksami Meisenheimera TNT, tworząc drugorzędowe diaryloaminy (van Dillewijn et al., 2008). Metabolity TNT pochodzące z redukcji nitrocząsteczek mogą również ulegać utlenieniu metylowych cząsteczek lub acetylacji aminowych cząsteczek (Stenuit i Agathos, 2010). Te różnorodne związki, ze względu na ich akumulację, są powszechnie nazywane metabolitami typu dead-end. Ponadto, tworzenie metabolitów samobójczych z powodu toksycznego działania produktów pośrednich i wtórnych, które powstają w wyniku redukcji nitrozwiązków, wydaje się być główną barierą dla produktywnego metabolizmu TNT (Lenke i in., 2000).
Figura 3. Biodegradacja nitro materiałów wybuchowych katalizowana przez (a) niektórych członków rodziny OYE (np., reduktaza PETN), (b) reduktazy F420-zależne z klastra npd, oraz (c) układ XplA-XplB.
Jednakże, niektórzy autorzy donoszą ostatnio o korzystnych szlakach biodegradacji TNT z (i) produkcją metabolizowanego związku 2,4-dinitrotoluenu (2,4-DNT) z monohydrycznego kompleksu Meisenheimera TNT (Stenuit i Agathos, 2010, Ziganshin i in., 2010a,b) oraz (ii) dowody przy użyciu sondowania stabilnymi izotopami (SIP) na asymilację 15 N i 13C z TNT do bakteryjnego DNA (Gallagher i in., 2010).
Wykorzystując zdolności kataboliczne drożdży Yarrowia lipolytica i Geotrichum candidum oraz zakwaszenie podłoża hodowlanego poprzez produkcję kwasów organicznych, Ziganshin et al. (2010a,b) donieśli o transformacji w warunkach kwaśnych (tj., przy pH < 4,2) C3–TNT do 2,4-DNT, mineralizowalnego metabolitu TNT-denitrowanego (Johnson i in., 2002), z równoczesnym uwolnieniem azotynów.
Przy użyciu DNA-SIP i T-RFLP, Gallagher et al. (2010) donieśli o wykorzystaniu TNT jako źródła węgla i azotu w warunkach sulfogenicznych przez szczep Lysobacter taiwanensis pierwotnie obecny w beztlenowych osadach estuarium bogatych w substancje organiczne. Jednakże, włączenie TNT do biomasy komórek Lysobacter jako głównego substratu lub współsubstratu (kometabolizm) pozostaje do wyjaśnienia. Mimo, że konieczne są dodatkowe eksperymenty w hodowlach aksenicznych w celu rozszyfrowania kompletnych ścieżek biodegradacji katalizowanych przez L. taiwanensis, jednoznaczne wykazanie asymilacji przez bakterie beztlenowe zarówno N jak i C z TNT stwarza nowe obiecujące możliwości remediacyjne, takie jak próby bioaugmentacji środowisk skażonych beztlenowym TNT.
Pomimo, że szlaki biodegradacji TNT opisywane w literaturze opierają się wyłącznie na kometabolizmie, specyficzne bakterie z rzędu Actinomycetales wykorzystują TNP jako jedyne źródło azotu, węgla i energii bez redukcji nitrocząsteczek (np, kwas piramidowy, monoaminowa pochodna TNP) (Hofmann i in., 2004). Główny szlak kataboliczny TNP polega na enzymatycznym przeniesieniu wodorku do jądra aromatycznego, po którym następują kolejne reakcje denitracji i skierowanie rozszczepionych metabolitów do cyklu kwasu trójkarboksylowego (TCA). Scharakteryzowano klaster genów degradacji TNP (npd cluster), identyfikując różne czynniki indukujące oraz regulator transkrypcji NpdR (Nga i in., 2004). Enzymami uczestniczącymi w obwodowych szlakach katabolicznych TNP w Rhodococcus opacus HL PM-1 są transferaza wodorkowa II (HTII), kodowana przez npdI, oraz transferaza wodorkowa I (HTI), kodowana przez npdC, które wytwarzają odpowiednio monohydryczny kompleks Meisenheimera TNP (-TNP) i dwuhydryczny kompleks Meisenheimera TNP (-TNP) (Nga i in., 2004). Aktywność HTII i HTI zależy od zależnej od NADPH reduktazy F420 (NdfR), kodowanej przez npdG, która działa jako transporter elektronów między NADPH i F420. Jak przedstawiono na Rysunku 3(b), przeniesienie wodorków ze zredukowanego koenzymu F420H2 do pierścienia aromatycznego TNP jest katalizowane przez HTII/HTI (Nga i in., 2004). W Nocardioides simplex FJ2-1A zachodzi ten sam obwodowy szlak kataboliczny TNP, z tym że unikalna transferaza wodorkowa (HT) katalizuje produkcję -TNP i -TNP (Hofmann i in., 2004). Następnie tautomeraza NpdH, kodowana przez npdH, katalizuje tautomeryzm z przesunięciem protonów w -TNP, tworząc w równowadze formę nitrową (R2C(- H)NO2) i formę aci-nitrową (R2C=N+(- O-)OH). Ta ostatnia ulega enzymatycznej reakcji denitracji katalizowanej przez bezkomórkowe ekstrakty R. opacus HL PM-1 lub N. simplex FJ2-1A (zawierające sierocą denitrazę), tworząc monohydryczny kompleks Meisenheimera 2,4-dinitrofenolu (2,4-DNP) (Hofmann et al., 2004). Po drugim uwodornieniu przez system HTI-NdfR (lub HT-NdfR), dwuwodny pośredni jest protonowany w pH 7.5, tworząc 2,4-dinitrocykloheksanon, który ulega katalizowanemu przez hydrolazę rozszczepieniu do 4,6-dinitroheksanianu. Ponieważ ten ostatni może być ostatecznie skierowany do cyklu TCA, biodegradacja TNP jest samopodtrzymująca i może zapewnić, w miejscach zanieczyszczonych wysokimi stężeniami TNP, selektywne korzyści dla mikroorganizmów degradujących.
W przypadku biodegradacji analogu TNT – tetrylu, wiadomo, że jego hydroliza może prowadzić do powstania TNP, który może ulec całkowitej biodegradacji mikrobiologicznej (Lewis i in., 2004). Enzymatyczna N-denitracja tetrylu w warunkach beztlenowych została również zaobserwowana z utworzeniem N-metylo-2,4,6-trinitroaniliny (Myers i Spinnato, 2007), związku trinitroaromatycznego, dla którego należy przeprowadzić eksperymenty nad biodegradacją.
Podsumowując, żaden pojedynczy mikroorganizm nie przeprowadza wystarczającej ilości reakcji, aby czerpać korzyści z biodegradacji TNT (Copley, 2009). Powstanie szlaku mineralizacji może być szybsze, gdy w obrębie jednego mikroba zachodzi kilka następujących po sobie reakcji. Chociaż katalizowana przez dioksygenazę eliminacja azotynów została opisana jako początkowa reakcja dla 2,6-DNP (Ecker i in., 1992), to atak elektrofilowy 2,4-DNP nie został do tej pory opisany ze względu na negatywny efekt indukcyjny grupy hydroksylowej i specyficzne przeszkody steryczne. Dlatego też, wstępne uwodornienie systemu pierścieni aromatycznych jest powszechnie obserwowane w przypadku 2,4-DNP i TNP, tak więc ich biodegradacja jest katalizowana przez ten sam mechanizm enzymatyczny w jednym mikroorganizmie. Z drugiej strony, w przypadku izomerów TNT i DNT zaobserwowano odmienne ścieżki biodegradacji. Rzeczywiście, 2,4-DNT i 2,6-DNT są całkowicie degradowane poprzez początkową reakcję dioksygenazy (Johnson et al., 2002). W związku z tym procesy syntroficzne, na przykład redukcyjna denitryfikacja TNT do 2,4-DNT, po której następuje utleniająca biotransformacja 2,4-DNT, zostały zaproponowane jako odpowiednia strategia mineralizacji TNT (Tront i Hughes, 2005). Jednakże podczas denitracji TNT w czystych i mieszanych hodowlach zachodzi wiele konkurencyjnych ścieżek, które w konsekwencji prowadzą do powstania martwych denitrowanych metabolitów, a nie izomerów DNT. W tym kontekście, eksperymentalne dowody na produkcję 2,4-DNT z biodegradacji TNT katalizowanej przez szczepy drożdży (Ziganshin i in., 2010a,b) mogą mieć podstawowe znaczenie dla wdrożenia procesu mineralizacji TNT.