Los ácidos nucleicos virales son inestables cuando se recogen, manipulan y almacenan de forma inadecuada, lo que provoca una disminución de la sensibilidad de los kits comerciales de pruebas cuantitativas de ácidos nucleicos actualmente disponibles. Utilizando ARN inestable conocido del virus de la hepatitis C, desarrollamos un método cuantitativo de RT-PCR basado en una nueva estrategia de diseño de cebadores para reducir el impacto de la inestabilidad de los ácidos nucleicos en las pruebas de ácidos nucleicos. Se evaluó el rendimiento del método en cuanto a linealidad, límite de detección, precisión, especificidad y concordancia con los ensayos comerciales del virus de la hepatitis C. Su aplicación clínica se comparó con la de dos kits comerciales: Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) y Kehua. El método cuantitativo de RT-PCR ofreció un buen rendimiento, con una linealidad de R2 = 0,99, un límite total de detección (genotipos 1 a 6) de 42,6 UI/mL (IC del 95%, 32,84 a 67,76 UI/mL), un CV de 1.06% a 3,34%, una especificidad del 100% y una alta concordancia con el ensayo CAP/CTM (R2 = 0,97), con un valor medio ± SD de -0,06 ± 1,96 log UI/mL (rango, -0,38 a 0,25 log UI/mL). El método fue superior a los ensayos comerciales en la detección del ARN inestable del virus de la hepatitis C (P < 0,05). Este método de RT-PCR cuantitativa puede eliminar eficazmente la influencia de la inestabilidad del ARN en las pruebas de ácido nucleico. El principio de la estrategia de diseño de cebadores puede aplicarse a la detección de otros virus de ARN o ADN.