Abstract
Listeria monocytogenes è uno dei patogeni alimentari più comuni. La carne e i prodotti di pollame sono tra i principali veicoli di ceppi patogeni di L. monocytogenes per l’uomo. I prodotti di pollame fanno parte della dieta regolare delle persone e, a causa del contenuto di nutrienti, più contenuto di proteine e meno contenuto di grassi, guadagnano più attenzione. In confronto alla carne rossa, la carne di pollame è più economica. Quindi, ha avuto un maggior tasso di consumo soprattutto in forma di barbecue in cui la crescita del batterio è favorita. La sottotipizzazione degli isolati di L. monocytogenes è essenziale per le indagini epidemiologiche e per l’identificazione della fonte di contaminazione. Nella seguente rassegna, saranno discussi i principali aspetti della presenza di L. monocytogenes nel pollame. La maggior parte dei sierotipi patogeni di L. monocytogenes sono stati rilevati in diversi prodotti di carne di pollame. Sfortunatamente, questi patogeni isolati avevano a volte resistenza agli antibiotici comunemente usati per il trattamento delle infezioni umane.
1. Caratteristiche di Listeria monocytogenes
Listeria spp. è un piccolo bastoncino gram-positivo (0,5-4 μm di diametro e 0,5-2 μm di lunghezza), non sporigeno, anaerobio facoltativo, catalasi positivo e ossidasi negativo. Listeria ha una motilità tumultuosa a 20-25°C dovuta a flagelli peritrichi. Sulla base degli antigeni somatici (O) e flagellari (H), sono stati identificati 13 sierotipi di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) tra cui 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, e 7 . Con l’aiuto del test PCR multiplex, quattro sierovari principali di ceppi di L. monocytogenes possono essere classificati in quattro sierogruppi distinti, IIa (sierovari 1/2a, 1/2c, 3a, e 3c), IIb (1/2b, 3b, 4b,4d, e 4e), IIc (1/2c e 3c), e IVb (4b, 4d, e 4e) puntando quattro geni marcatori. Il cibo o l’ambiente di produzione alimentare è comunemente contaminato dai sierotipi 1/2a, 1/2b, 1/2c, e 4b. La temperatura ottimale di crescita di L. monocytogenes è di 30-37°C, ma può sopravvivere tra 0 e 45°C. L. monocytogenes può moltiplicarsi a temperature da frigorifero, è resistente ai disinfettanti e aderisce a varie superfici. Una volta introdotto negli impianti di lavorazione, è in grado di sopravvivere e rimanere per un lungo periodo in condizioni avverse. Nell’industria alimentare, L. monocytogenes è in grado di formare biofilm che possono agire come una potenziale fonte di contaminazione. L. monocytogenes è un organismo ampiamente distribuito in natura, con serbatoi principali nel suolo e nel foraggio. Inoltre, è stato isolato da esseri umani e animali sani o da animali domestici e selvatici infetti.
2. Listeriosi
L. monocytogenes è la causa principale della listeriosi di origine alimentare nell’uomo. Raramente sono state riportate infezioni alimentari da L. ivanovii e L. seeligeri. I ceppi di L. monocytogenes hanno un diverso potenziale patogeno, poiché alcuni ceppi sono molto virulenti, mentre altri sono agenti non infettivi. La determinazione del potenziale patogeno di L. monocytogenes è importante dal punto di vista della sicurezza alimentare e della salute pubblica. L’identificazione dei ceppi virulenti può essere ottenuta tracciando alcuni geni direttamente collegati alla patogenicità di L. monocytogenes. L. monocytogenes entra nelle cellule dell’ospite utilizzando una famiglia di proteine di superficie chiamate internaline, in particolare InlA e InlB. Inoltre, InlC e InlJ partecipano anche alle fasi postintestinali dell’infezione da L. monocytogenes. Le internine putative di L. monocytogenes sono codificate dai geni inlC (lmo1786) e inlJ (lmo2821). L’organismo eziologico della listeriosi umana ospita inlJ (lmo2821). L. monocytogenes porta una tossina poroformante chiamata listeriolisina O (LLO) (una proteina di 58 KDa codificata dal gene hlyA) che è vitale per la virulenza del batterio. LLO liscia la membrana del vacuolo e infine assiste l’ingresso di L. monocytogenes nel citoplasma. Diversi metodi sono stati utilizzati per valutare la virulenza di L. monocytogenes. Alcuni di essi includono il test di virulenza del topo, la coltura cellulare e l’uso di geni e proteine specifiche. La tabella 1 mostra alcuni geni specifici utilizzati per determinare la virulenza degli isolati di L. monocytogenes nel pollame.
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La listeriosi di origine alimentare ha tre caratteristiche cliniche principali: meningite, setticemia e aborto. Negli esseri umani sani può causare una gastroenterite febbrile, ma nelle persone suscettibili (bambini, anziani, immunodepressi e donne incinte) può portare a setticemia e meningite .
La listeriosi è la quarta malattia zoonotica in Europa, con un’incidenza annuale di 0,41 casi per 100.000 abitanti . Nei paesi asiatici, le segnalazioni di listeriosi esistono raramente a causa della mancata rilevazione o segnalazione. Inoltre, può essere dovuto al tasso di incidenza inferiore o all’esclusione della listeriosi per la diagnosi differenziale da parte dei clinici. Tuttavia, L. monocytogenes è stato considerato come uno dei fattori eziologici di aborti spontanei e nati morti in India.
Le persone con più di 65 anni e i neonati hanno avuto i tassi più alti di infezione da L. monocytogenes. La trasmissione materna ai neonati è stata riportata nel 79% dei casi. La listeriosi ha il più alto tasso di mortalità tra le malattie di origine alimentare. L’isolamento di L. monocytogenes da diversi tipi di alimenti RTE lo ha reso un patogeno di origine alimentare notevole.
3. Sottotipizzazione di L. monocytogenes
A causa dei diversi ceppi di L. monocytogenes, la sottotipizzazione degli isolati per la genetica della popolazione, il monitoraggio della fonte e l’indagine epidemiologica è fondamentale per il controllo e la prevenzione della listeriosi. La tipizzazione di L. monocytogenes è necessaria per identificare le fonti di contaminazione e indagare sui focolai di listeriosi di origine alimentare. La sottotipizzazione fenotipica e genotipica sono i due metodi principali utilizzati dai ricercatori. Come metodo fenotipico, la sierotipizzazione è generalmente utilizzata per i ceppi di L. monocytogenes legati ai focolai di malattia. A causa del coinvolgimento di soli tre sierotipi nei focolai di listeriosi e del basso potere discriminatorio della sierotipizzazione nel distinguere i sierotipi 4a, 4b e 4c, la sierotipizzazione non ha abbastanza potere per la sottotipizzazione di L. monocytogenes. Quindi, la procedura di sottotipizzazione basata sulla PCR, come la reazione a catena della polimerasi con amplificazione casuale del DNA polimorfico (RAPD-PCR), la Repetitive Extragenic Palindromes-PCR (REP-PCR), la Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR), e l’elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) guadagnano più attenzione in questi giorni. Il test RAPD ha amplificato alcune regioni casuali nei genomi di L. monocytogenes che generano modelli distinti. RAPD è più conveniente e più veloce di altri metodi di tipizzazione, specialmente per un basso numero di ceppi. La tecnica RAPD-PCR è uno dei metodi principali per la caratterizzazione dei ceppi batterici. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) è un metodo altamente affidabile, semplice ed economico che è in grado di produrre una chiara impronta digitale in Listeria. L’analisi ERIC-PCR può separare gli isolati dello stesso sierotipo. Inoltre, è in grado di differenziare gli isolati di L. monocytogenes che sono stati rilevati in un campione con sierotipo simile.
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) ha amplificato uno o alcuni dei geni housekeeping o associati alla virulenza (ad esempio, hly, actA e inlA) di L. monocytogenes e poi digerito i prodotti PCR con enzimi di restrizione. Ha bisogno di un basso numero di copie di DNA per eseguire l’esperimento. Ma, ha un potere discriminatorio inferiore e dovrebbe essere usato insieme ad altre tecniche di sottotipizzazione ed è anche più costoso del test RAPD. Uno degli altri metodi di genotipizzazione degli isolati di L. monocytogenes è il metodo Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP). In AFLP, la digestione del DNA degli isolati è stata fatta con due enzimi di restrizione tra cui EcoRI, MseI, o TaqI. Uno dei principali vantaggi di AFLP è l’alto potere discriminatorio di questo test. Al contrario, l’insidia di questo metodo è la bassa precisione nelle dimensioni dei frammenti, che porta ad una minore riproducibilità.
PFGE è uno strumento in cui, esponendo un grande frammento di DNA al cambiamento del campo elettrico, gli isolati sono stati sottotipizzati. Questa tecnica è stata più discriminatoria dell’AFLP, ma richiede più tempo, è costosa e richiede più lavoro rispetto all’AFLP.
L. monocytogenes ha anche alcuni elementi di sequenza ripetitivi dispersi in modo casuale, come i palindromi extragenici ripetitivi (REP) di 35-40 bp con una ripetizione invertita. Queste regioni forniscono alcuni punti utili per la distinzione dei ceppi di L. monocytogenes isolati. Utilizzando la REP-PCR, è stata identificata l’origine degli isolati. Ha un livello di discriminazione uguale a quello della PFGE. Quindi è suggerita come una tecnica adatta per la tipizzazione rapida di questi isolati.
4. Listeria nel pollame
4.1. Prevalenza di Listeria Spp. e L. monocytogenes nel pollame
Uno dei veicoli principali di Listeria è il pollame che può diffondere l’organismo nell’ambiente e nelle carcasse di pollame a causa di pratiche non igieniche. Occasionalmente, Listeria è stata isolata dalle feci del pollame e del pollo. Listeria spp. è stata rilevata in vari prodotti avicoli. Secondo altri studi, dall’8% al 99% dei prodotti avicoli sono stati contaminati da Listeria spp.
L. monocytogenes è stato precedentemente segnalato da diversi prodotti avicoli, da quelli crudi a quelli cotti. Schäfer et al. (2018) hanno riportato il tasso di contaminazione di campioni di petto e coscia di pollo come 8,64 e 44,19%, rispettivamente . Il 12,7% della carne di tacchino è risultato positivo a L. monocytogenes . La tabella 2 mostra il tasso di contaminazione della carne e dei prodotti di pollame con Listeria spp. e L. monocytogenes.
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Secondo la tabella 2, la carne e i prodotti avicoli crudi erano più contaminati da L. monocytogenes rispetto a quelli cotti.
4.2. Sierotipi di Listeria monocytogenes nel pollame
I sierotipi 1/2b e 3b (sierogruppo IIb) di L. monocytogenes sono stati i sierotipi predominanti isolati (52,77%) nelle carcasse di pollo in Iran, e il sierogruppo IVa che contiene i sierotipi 4a e 4c è stato rilevato anche nel 27,77% delle carcasse di pollo. Il sierotipo più comune nei prodotti di pollame negli USA era lo stesso. Ma in un altro studio, il sierotipo 4b è stato riportato come il sierotipo più comune nei prodotti di pollame che è stato rilevato nel 44,9% dei campioni, mentre la prevalenza del sierotipo 1/2b era del 10,2% .
La prevalenza del sierogruppo IVb era del 2,77% e del 12,5% nelle carcasse di pollo e negli alimenti RTE, rispettivamente. La listeriosi umana è causata principalmente dai sierotipi 1/2a, 1/2b e 4b di L. monocytogenes. Tuttavia, il sierotipo 4b non è stato trovato comunemente negli alimenti.
I campioni di carne di tacchino fresca confezionata sono stati contaminati dai sierotipi di L. monocytogenes come segue: 4b (o 4d, 4e) (51,4%), 1/2a (o 3a) (27,0%), e 1/2b (o 3b) (21,6%) . Tuttavia, il sierotipo 4b è stato isolato frequentemente dalla carne e dalle cosce di tacchino, mentre 1/2b era prevalente nei campioni di petto di tacchino.
Circa il 16,66% delle carcasse di pollo campionate in Iran erano contaminate dal sierogruppo IIa contenente i sierotipi 1/2a, 3a, 1/2c e 3c. Un altro studio sierologico su prodotti di pollame ha riportato il sierotipo 1/2a nel 40,8% e il sierotipo 1/2c nel 4,08% dei campioni. In altri studi, il sierotipo 1/2a era il sierotipo predominante nei prodotti di pollame del Portogallo e dell’Estonia, mentre in Finlandia il sierotipo 1/2c era il principale. I sierogruppi identificati negli alimenti RTE erano 1/2a, 3a e 1/2c, 3c con una percentuale del 65,6% e 21,9%, rispettivamente. Sulla base degli studi di cui sopra, la carne di pollame è una fonte potenziale di sierotipi patogeni di L. monocytogenes.
4.3. Suscettibilità antimicrobica di Listeria monocytogenes
Listeria spp. è resistente agli agenti antimicrobici a causa di elementi genetici mobili diffusi e trasposoni coniugativi. Dodici dei 36 isolati di L. monocytogenes erano sensibili a 11 agenti antimicrobici testati. Nessuno degli isolati aveva resistenza all’ampicillina e alla vancomicina. Alcuni ricercatori hanno osservato la resistenza all’ampicillina negli isolati di L. monocytogenes, ma tutti i loro isolati erano sensibili alla vancomicina. Zeinali et al. (2017) hanno osservato la resistenza all’eritromicina nel 52,77% degli isolati di L. monocytogenes ma, in un altro studio, è stata riportata nel 15,2% degli isolati. 8 dei 23 isolati di L. monocytogenes avevano resistenza all’eritromicina. La resistenza alla penicillina è un risultato comune in un certo numero di studi. Inoltre, l’alta suscettibilità di L. monocytogenes all’ampicillina e alla penicillina è anche riportata. La tetraciclina è un agente antimicrobico di uso frequente negli allevamenti di pollame e anche nel trattamento delle infezioni umane. La resistenza a questo agente è sempre osservata in L. monocytogenes. Un basso numero di isolati era resistente alla gentamicina. La terapia standard della listeriosi è fatta con l’uso di ampicillina o penicillina G insieme a un aminoglicoside come la gentamicina. La seconda linea di trattamento appartiene al trimetoprim. La resistenza al trimetoprim in L. monocytogenes contribuisce al plasmide pIP823. C’è un’alta suscettibilità a questo agente tra gli isolati di L. monocytogenes dagli alimenti. La maggior parte degli isolati di L. monocytogenes aveva una resistenza multi-farmaco. Fortunatamente, sono per lo più sensibili agli antibiotici comunemente usati per curare la listeriosi umana.
4.4. Tipizzazione degli isolati di L. monocytogenes nel pollame
Isolati di L. monocytogenes con lo stesso cluster RAPD appartengono a diversi sierogruppi. Quattro diversi cluster sono stati distinti tra 26 isolati di L. monocytogenes da carcasse di pollo attraverso l’analisi RAPD con tre diversi primer, ovvero OPM-01, HLWL 74, e D8635 . Questi 26 isolati di L. monocytogenes avevano 16 modelli di antibiogramma.
L. monocytogenes isolati con pulse-types simili sono stati classificati nello stesso cluster nel test RAPD. Erano anche clonalmente correlati. Diversi laboratori hanno utilizzato il test RAPD per la sottotipizzazione degli isolati di L. monocytogenes, compresi gli isolati provenienti da diversi impianti di lavorazione del pollame.
Diversi isolati di alimenti RTE sono stati tipizzati da RAPD, anche se erano indistinguibili da REP-PCR. Ventotto isolati di L. monocytogenes dalla carne di pollo avevano 27 tipi RAPD. Erano resistenti a tre o più agenti antimicrobici.
Quindici isolati di L. monocytogenes dalle anatre avevano tre modelli di antibiogramma, cinque cluster RAPD e tre singleton. Quindi, RAPD aveva un potere maggiore nel distinguere gli isolati.
I polli e gli isolati umani di L. monocytogenes sono stati classificati in cinque cluster nel test RAPD. Tutti gli isolati umani sono stati classificati in un cluster. Questi isolati avevano diversi sierogruppi. Era un risultato comune in altri studi. Può essere dovuto all’amplificazione di loci aspecifici nel test RAPD. La maggior parte delle somiglianze genetiche sono state osservate tra gli isolati che avevano una zona di campionamento comune. Lo stesso cluster RAPD è stato visto in alcuni ceppi di Lactobacillus di origine comune. Il potere di discriminazione del test RAPD è superiore alla sierotipizzazione. Gli isolati nello stesso profilo RAPD avevano sierotipi diversi e sono stati rilevati in aree diverse.
29 isolati e 5 ceppi di riferimento di L. monocytogenes sono stati raggruppati in 4 cluster e 1 singoletto da REP-PCR. C’era un’alta diversità genetica tra gli isolati. Secondo Shi et al. (2015), gli isolati appartenenti allo stesso sierotipo e origine avevano lo stesso cluster in REP-PCR. 15 isolati di L. monocytogenes dalle anatre e dai loro ambienti sono stati tipizzati con RAPD e REP. Sono stati classificati in 5 cluster e 3 singleton, e 2 cluster e 3 singleton, rispettivamente. Questo risultato ha proposto l’idoneità di questi strumenti per la discriminazione dei ceppi. Soni et al. (2012) hanno anche osservato che gli isolati clinici di L. monocytogenes avevano impronte digitali ERIC e REP simili, ma sono abbastanza diversi dagli isolati di acqua e latte . Oliveira et al. (2018) hanno trovato 12 genotipi tra 38 isolati di L. monocytogenes. 40 isolati di L. monocytogenes hanno prodotto 10 diversi profili di impronte digitali in ERIC-PCR. Impronte simili sono state viste per gli isolati dello stesso campione, ma c’erano due ceppi in un campione con impronte diverse. L. monocytogenes aveva un’alta diversità genetica, e per una buona differenziazione degli isolati è necessario l’uso di almeno due approcci di sottotipizzazione.
5. Conclusione
In conclusione, dal punto di vista della sicurezza alimentare, la presenza di L. monocytogenes nella carne e nei prodotti di pollame è un potenziale pericolo multiforme. Ciò è dovuto, in primo luogo, ad alcuni cibi grigliati e fritti a base di carne di pollo che possono portare alla sopravvivenza di L. monocytogenes nei prodotti finali e, in secondo luogo, alla presenza di isolati multiresistenti che trasferiscono la resistenza agli antibiotici alla comunità. Inoltre, alcuni degli isolati erano sierotipi patogeni che giocano un ruolo importante nelle epidemie di listeriosi umana. I dati di sottotipizzazione hanno rivelato la natura eterogenea degli isolati di L. monocytogenes. RAPD, REP-PCR e ERIC-PCR hanno un notevole potere discriminatorio e sono economicamente efficaci e meno noiosi e dispendiosi in termini di tempo.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.