Abstract
Listeria monocytogenes ist einer der häufigsten lebensmittelbedingten Krankheitserreger. Geflügelfleisch und -produkte sind einer der Hauptträger von pathogenen Stämmen von L. monocytogenes für den Menschen. Geflügelprodukte sind Teil der regulären Ernährung des Menschen und gewinnen aufgrund des Nährstoffgehalts, des höheren Gehalts an Eiweiß und des geringeren Gehalts an Fett mehr Aufmerksamkeit. Im Vergleich zu rotem Fleisch ist Geflügelfleisch preiswerter. Daher wurde es häufiger verzehrt, vor allem in gegrillter Form, in der das Wachstum des Bakteriums begünstigt wird. Die Subtypisierung von L. monocytogenes-Isolaten ist für epidemiologische Untersuchungen und zur Identifizierung der Kontaminationsquelle unerlässlich. In der folgenden Übersicht werden die wichtigsten Facetten des Vorkommens von L. monocytogenes in Geflügel diskutiert. Die meisten pathogenen Serotypen von L. monocytogenes wurden in verschiedenen Produkten aus Geflügelfleisch nachgewiesen. Leider wiesen diese isolierten Erreger teilweise Resistenzen gegen gängige Antibiotika auf, die zur Behandlung von Infektionen beim Menschen eingesetzt werden.
1. Merkmale von Listeria monocytogenes
Listeria spp. sind kleine gram-positive Stäbchen (0,5-4 μm im Durchmesser und 0,5-2 μm in der Länge), nicht sporenbildend, fakultativ anaerob, Katalase-positiv und Oxidase-negativ. Listeria hat eine taumelnde Motilität bei 20-25°C durch peritriche Geißeln. Basierend auf somatischen (O) und flagellaren (H) Antigenen wurden bei Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) 13 Serotypen identifiziert, darunter 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e und 7 . Mit Hilfe des Multiplex-PCR-Tests können die vier wichtigsten Serovare von L. monocytogenes-Stämmen in vier verschiedene Serogruppen eingeteilt werden: IIa (Serovare 1/2a, 1/2c, 3a und 3c), IIb (1/2b, 3b, 4b, 4d und 4e), IIc (1/2c und 3c) und IVb (4b, 4d und 4e), indem vier Markergene untersucht werden. Lebensmittel oder die Umgebung der Lebensmittelproduktion sind häufig mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c und 4b kontaminiert. Die optimale Wachstumstemperatur von L. monocytogenes liegt bei 30-37°C, er kann aber auch zwischen 0 und 45°C überleben. L. monocytogenes kann sich bei Kühlschranktemperaturen vermehren, ist resistent gegen Desinfektionsmittel und haftet an verschiedenen Oberflächen. Einmal in die Verarbeitungsbetriebe eingeschleppt, ist er in der Lage, unter ungünstigen Bedingungen lange zu überleben und zu verbleiben. In der Lebensmittelindustrie ist L. monocytogenes in der Lage, einen Biofilm zu bilden, der als potenzielle Kontaminationsquelle dienen kann. L. monocytogenes ist ein in der Natur weit verbreiteter Organismus, dessen Hauptreservoire der Boden und das Futter sind. Außerdem wurde er von gesunden Menschen und Tieren oder infizierten Haus- und Wildtieren isoliert.
2. Listeriose
L. monocytogenes ist die Hauptursache für lebensmittelbedingte Listeriose beim Menschen. Seltener wurden lebensmittelbedingte Infektionen durch L. ivanovii und L. seeligeri berichtet. Stämme von L. monocytogenes haben ein unterschiedliches pathogenes Potenzial, da einige Stämme sehr virulent sind, während andere nicht infektiös sind. Die Bestimmung des pathogenen Potenzials von L. monocytogenes ist aus Sicht der Lebensmittelsicherheit und der öffentlichen Gesundheit wichtig. Die Identifizierung virulenter Stämme kann durch die Verfolgung einiger Gene erreicht werden, die direkt mit der Pathogenität von L. monocytogenes zusammenhängen. L. monocytogenes dringt in Wirtszellen ein, indem es eine Familie von Oberflächenproteinen nutzt, die Internaline genannt werden, insbesondere InlA und InlB. Darüber hinaus sind InlC und InlJ auch an den postintestinalen Stadien der L. monocytogenes-Infektion beteiligt. Putative Internaline von L. monocytogenes werden von den Genen inlC (lmo1786) und inlJ (lmo2821) kodiert. Der ätiologische Organismus der Listeriose des Menschen trägt inlJ (lmo2821) . L. monocytogenes trägt ein porenbildendes Toxin namens Listeriolysin O (LLO) (ein 58 KDa-Protein, das vom hlyA-Gen kodiert wird), das für die Virulenz des Bakteriums entscheidend ist. LLO lysiert die Membran der Vakuole und unterstützt schließlich den Eintritt von L. monocytogenes in das Zytoplasma. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um die Virulenz von L. monocytogenes zu beurteilen. Einige davon sind der Maus-Virulenz-Assay, die Zellkultur und die Verwendung von spezifischen Genen und Proteinen. Tabelle 1 zeigt einige spezifische Gene, die zur Bestimmung der Virulenz von L. monocytogenes-Isolaten in Geflügel verwendet wurden.
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Die lebensmittelbedingte Listeriose hat drei klinische Hauptmerkmale, nämlich Meningitis, Septikämie und Abort. Bei gesunden Menschen kann sie eine fiebrige Gastroenteritis verursachen, aber bei empfindlichen Personen (Kinder, ältere Menschen, immungeschwächte Menschen und Schwangere) kann sie zu Septikämie und Meningitis führen.
Die Listeriose ist die vierthäufigste zoonotische Erkrankung in Europa, mit einer jährlichen Inzidenz von 0,41 Fällen pro 100.000 Einwohner. In asiatischen Ländern gibt es nur selten Berichte über Listeriose, weil sie nicht erkannt oder gemeldet werden. Auch kann es an der geringeren Inzidenzrate oder am Ausschluss der Listeriose für die Differentialdiagnose durch Kliniker liegen. Allerdings gilt L. monocytogenes als einer der ätiologischen Faktoren von Spontanaborten und Totgeburten in Indien.
Personen über 65 Jahre und Neugeborene hatten die höchsten Raten von Infektionen mit L. monocytogenes . Eine mütterliche Übertragung auf Neugeborene wurde in 79 % der Fälle berichtet. Die Listeriose hat die höchste Sterblichkeitsrate unter den lebensmittelbedingten Krankheiten. Die Isolierung von L. monocytogenes aus verschiedenen Arten von RTE-Lebensmitteln machte es zu einem bemerkenswerten lebensmittelbedingten Krankheitserreger.
3. Subtypisierung von L. monocytogenes
Da es verschiedene Stämme von L. monocytogenes gibt, ist die Subtypisierung von Isolaten für die Populationsgenetik, die Rückverfolgung der Quelle und die epidemiologische Untersuchung von entscheidender Bedeutung für die Kontrolle und Prävention von Listeriose. Die Typisierung von L. monocytogenes ist notwendig, um die Kontaminationsquellen zu identifizieren und lebensmittelbedingte Listerioseausbrüche zu untersuchen. Die phänotypische und genotypische Subtypisierung sind die beiden Hauptmethoden, die von Forschern verwendet wurden. Als phänotypische Methode wird die Serotypisierung im Allgemeinen für L. monocytogenes-Stämme verwendet, die mit Krankheitsausbrüchen in Verbindung stehen. Aufgrund der Beteiligung von nur drei Serotypen an Listerioseausbrüchen und der geringen Trennschärfe der Serotypisierung bei der Unterscheidung der Serotypen 4a, 4b und 4c hat die Serotypisierung keine ausreichende Aussagekraft für die Subtypisierung von L. monocytogenes. Daher gewinnen PCR-basierte Subtypisierungsverfahren wie Random Amplification of Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR), Repetitive Extragenic Palindromes-PCR (REP-PCR), Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) und Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) heutzutage mehr Aufmerksamkeit. Der RAPD-Assay amplifiziert einige zufällige Regionen in den Genomen von L. monocytogenes, die unterschiedliche Muster erzeugen. RAPD ist kostengünstiger und schneller als andere Typisierungsmethoden, insbesondere bei einer geringen Anzahl von Stämmen. Die RAPD-PCR-Technik ist eine der wichtigsten Methoden zur Charakterisierung von Bakterienstämmen. Die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) ist eine sehr zuverlässige, einfache und kostengünstige Methode, die in der Lage ist, einen eindeutigen Fingerabdruck bei Listeria zu erzeugen. Die ERIC-PCR-Analyse kann die Isolate desselben Serotyps voneinander trennen. Außerdem ist sie in der Lage, L. monocytogenes-Isolate zu unterscheiden, die in einer Probe mit ähnlichem Serotyp nachgewiesen wurden.
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) amplifizierten eines oder einige der Housekeeping- oder Virulenz-assoziierten Gene (z. B. hly, actA und inlA) von L. monocytogenes und verdauten dann PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen. Für die Durchführung des Experiments wird eine geringe Kopienzahl der DNA benötigt. Er hat jedoch eine geringere Trennschärfe und sollte zusammen mit anderen Subtypisierungstechniken verwendet werden und ist auch teurer als der RAPD-Assay . Eine der anderen Methoden zur Genotypisierung von L. monocytogenes-Isolaten ist die Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP)-Methode. Bei der AFLP-Methode wurde die DNA der Isolate mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, darunter EcoRI, MseI oder TaqI . Einer der Hauptvorteile von AFLP ist die hohe Trennschärfe dieses Tests . Im Gegensatz dazu ist der Fallstrick dieser Methode die geringe Präzision bei den Fragmentgrößen, was zu einer geringeren Reproduzierbarkeit führt.
PFGE ist ein Werkzeug, bei dem, indem große DNA-Fragmente einem sich ändernden elektrischen Feld ausgesetzt werden, Isolate subtypisiert wurden. Diese Technik war diskriminierender als AFLP, ist aber im Vergleich zu AFLP zeitaufwändiger, teurer und arbeitsintensiver.
L. monocytogenes hat auch einige zufällig verteilte, repetitive Sequenzelemente, wie z. B. repetitive extragene Palindrome (REPs) von 35-40 bp mit einer invertierten Wiederholung. Diese Regionen bieten einige nützliche Punkte zur Stammunterscheidung von L. monocytogenes-Isolaten. Mittels REP-PCR wurde der Ursprung der Isolate identifiziert. Sie hat ein gleichwertiges Unterscheidungsvermögen wie PFGE. Daher wird sie als geeignete Technik für die schnelle Typisierung dieser Isolate vorgeschlagen.
4. Listeria in the Poultry
4.1. Prävalenz von Listeria spp. und L. monocytogenes in Geflügel
Einer der Hauptüberträger von Listerien sind Geflügelbestände, die den Organismus aufgrund unhygienischer Praktiken in die Umwelt und in Geflügelkadaver verbreiten können. Gelegentlich wurden Listerien aus den Fäkalien von Geflügel und Hühnern isoliert. Listeria spp. wurden in verschiedenen Geflügelprodukten nachgewiesen. Nach anderen Studien waren 8 % bis 99 % der Geflügelprodukte mit Listeria spp. kontaminiert.
L. monocytogenes wurde zuvor aus verschiedenen Geflügelprodukten, von rohen bis zu gekochten Produkten, berichtet . Schäfer et al. (2018) berichteten von einer Kontaminationsrate von Brust- und Schenkelproben von Hähnchenfleisch von 8,64 bzw. 44,19 % . 12,7 % des Putenfleischs waren positiv für L. monocytogenes . Tabelle 2 zeigt die Kontaminationsrate von Geflügelfleisch und -produkten mit Listeria spp. und L. monocytogenes.
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Nach Tabelle 2 waren rohes Geflügelfleisch und -produkte stärker mit L. monocytogenes kontaminiert als gekochtes.
4.2. Serotypen von Listeria monocytogenes in Geflügel
Die Serotypen 1/2b und 3b (Serogruppe IIb) von L. monocytogenes waren die vorherrschenden isolierten Serotypen (52,77 %) in Hühnerschlachtkörpern im Iran, und die Serogruppe IVa, die die Serotypen 4a und 4c enthält, wurde ebenfalls in 27,77 % der Hühnerschlachtkörper nachgewiesen. Der häufigste Serotyp in Geflügelprodukten in den USA war derselbe. In einer anderen Studie wurde jedoch der Serotyp 4b als der häufigste Serotyp in Geflügelprodukten berichtet, der in 44,9 % der Proben nachgewiesen wurde, während die Prävalenz des Serotyps 1/2b 10,2 % betrug.
Die Prävalenz der Serogruppe IVb betrug 2,77 % bzw. 12,5 % in Hühnerschlachtkörpern und RTE-Lebensmitteln . Die Listeriose beim Menschen wird hauptsächlich durch die Serovare 1/2a, 1/2b und 4b von L. monocytogenes verursacht. Der Serotyp 4b wurde jedoch nicht häufig in Lebensmitteln gefunden.
Frisch verpackte Putenfleischproben waren wie folgt mit L. monocytogenes Serotypen kontaminiert: 4b (oder 4d, 4e) (51,4 %), 1/2a (oder 3a) (27,0 %) und 1/2b (oder 3b) (21,6 %) . Allerdings wurde der Serotyp 4b häufig aus Putenfleisch und -keulen isoliert, während 1/2b in Putenbrustproben vorherrschend war.
Ungefähr 16,66 % der im Iran beprobten Hühnerschlachtkörper waren mit Serogruppe IIa kontaminiert, die die Serotypen 1/2a, 3a, 1/2c und 3c enthielt. In einer anderen serologischen Studie über Geflügelprodukte wurde der Serotyp 1/2a in 40,8 % und der Serotyp 1/2c in 4,08 % der Proben nachgewiesen. In anderen Studien war der Serotyp 1/2a der vorherrschende Serotyp in Geflügelprodukten in Portugal und Estland, während in Finnland 1/2c der vorherrschende Serotyp war. Die identifizierten Serogruppen in RTE-Lebensmitteln waren 1/2a, 3a und 1/2c, 3c mit einer Rate von 65,6% bzw. 21,9%. Basierend auf den oben genannten Studien ist Geflügelfleisch eine potentielle Quelle für pathogene Serotypen von L. monocytogenes.
4.3. Antimikrobielle Empfindlichkeit von Listeria monocytogenes
Listeria spp. sind aufgrund weit verbreiteter mobiler genetischer Elemente und konjugativer Transposons resistent gegen antimikrobielle Wirkstoffe . Zwölf von 36 L. monocytogenes-Isolaten waren empfindlich gegenüber 11 getesteten antimikrobiellen Wirkstoffen . Keines der Isolate wies eine Resistenz gegen Ampicillin und Vancomycin auf. Einige Forscher beobachteten bei L. monocytogenes-Isolaten eine Resistenz gegen Ampicillin, aber alle ihre Isolate waren empfindlich gegen Vancomycin . Zeinali et al. (2017) beobachteten eine Resistenz gegen Erythromycin bei 52,77 % der L. monocytogenes-Isolate, aber in einer anderen Studie wurde sie bei 15,2 % der Isolate festgestellt. 8 von 23 der L. monocytogenes-Isolate wiesen eine Resistenz gegen Erythromycin auf. Resistenz gegen Penicillin ist ein gemeinsamer Befund in einer Reihe von Studien . Darüber hinaus wurde auch eine hohe Empfindlichkeit von L. monocytogenes gegenüber Ampicillin und Penicillin berichtet. Tetracyclin ist ein antimikrobielles Mittel, das häufig in Geflügelfarmen und auch bei der Behandlung von Infektionen beim Menschen eingesetzt wird. Resistenzen gegen dieses Mittel werden bei L. monocytogenes immer wieder beobachtet. Eine geringe Anzahl von Isolaten war gegen Gentamycin resistent. Die Standardtherapie der Listeriose erfolgt durch den Einsatz von Ampicillin oder Penicillin G zusammen mit einem Aminoglykosid wie Gentamicin. Die zweite Linie der Behandlung gehört zu Trimethoprim. Die Resistenz gegen Trimethoprim bei L. monocytogenes geht auf das pIP823-Plasmid zurück. Es besteht eine hohe Empfindlichkeit gegenüber diesem Wirkstoff bei L. monocytogenes-Isolaten aus Lebensmitteln. Die meisten der L. monocytogenes-Isolate wiesen eine Multidrug-Resistenz auf. Glücklicherweise sind sie meist empfindlich gegenüber gängigen Antibiotika, die zur Heilung der menschlichen Listeriose eingesetzt wurden.
4.4. Typisierung von L. monocytogenes-Isolaten in Geflügel
Isolate von L. monocytogenes mit demselben RAPD-Cluster gehörten zu verschiedenen Serogruppen. Vier verschiedene Cluster wurden unter 26 Isolaten von L. monocytogenes aus Hühnerschlachtkörpern durch RAPD-Analyse mit drei verschiedenen Primern unterschieden, nämlich OPM-01, HLWL 74 und D8635 . Diese 26 Isolate von L. monocytogenes hatten 16 Antibiogramm-Muster.
L. monocytogenes-Isolate mit ähnlichen Impuls-Typen wurden im RAPD-Assay im gleichen Cluster klassifiziert. Sie waren auch klonal verwandt . Verschiedene Labore verwendeten den RAPD-Test zur Subtypisierung von L. monocytogenes-Isolaten , einschließlich Isolaten aus verschiedenen Geflügelverarbeitungsbetrieben.
Einige Isolate von RTE-Lebensmitteln wurden durch RAPD typisiert, obwohl sie durch REP-PCR nicht unterscheidbar waren . Achtundzwanzig Isolate von L. monocytogenes aus Hühnerfleisch wiesen 27 RAPD-Typen auf. Sie waren gegen drei oder mehr antimikrobielle Mittel resistent.
Fünfzehn Isolate von L. monocytogenes aus Enten hatten drei Antibiogramm-Muster, fünf RAPD-Cluster und drei Singletons. RAPD hatte also eine höhere Leistung bei der Unterscheidung von Isolaten.
Hühner- und Humanisolate von L. monocytogenes wurden im RAPD-Assay in fünf Cluster klassifiziert. Alle humanen Isolate wurden in einen Cluster kategorisiert. Diese Isolate hatten unterschiedliche Serogruppen. Dies war ein gemeinsamer Befund in anderen Studien. Dies kann auf die Amplifikation von unspezifischen Loci im RAPD-Test zurückzuführen sein. Die meisten genetischen Ähnlichkeiten wurden bei Isolaten festgestellt, die ein gemeinsames Probenahmegebiet hatten. Der gleiche RAPD-Cluster wurde bei einigen Lactobacillus-Stämmen aus einer gemeinsamen Quelle gefunden. Die Trennschärfe des RAPD-Tests ist höher als bei der Serotypisierung. Isolate mit demselben RAPD-Profil hatten unterschiedliche Serotypen und wurden in verschiedenen Gebieten nachgewiesen.
29 Isolate und 5 Referenzstämme von L. monocytogenes wurden durch REP-PCR in 4 Cluster und 1 Singleton gruppiert. Es zeigte sich eine hohe genetische Diversität unter den Isolaten. Nach Shi et al. (2015) hatten Isolate, die zum gleichen Serotyp und Ursprung gehörten, den gleichen Cluster in der REP-PCR. 15 Isolate von L. monocytogenes aus Enten und deren Umgebung wurden mittels RAPD und REP typisiert. Sie wurden in 5 Cluster und 3 Singletons bzw. 2 Cluster und 3 Singletons eingeteilt. Dieses Ergebnis schlug die Eignung dieser Werkzeuge zur Unterscheidung der Stämme vor . Soni et al. (2012) beobachteten ebenfalls, dass klinische Isolate von L. monocytogenes ähnliche ERIC- und REP-Fingerabdrücke aufwiesen, sich aber deutlich von den Wasser- und Milchisolaten unterschieden . Oliveira et al. (2018) fanden 12 Pulsotypen unter 38 Isolaten von L. monocytogenes . 40 Isolate von L. monocytogenes erzeugten 10 verschiedene Fingerprint-Profile in der ERIC-PCR. Ähnliche Fingerabdrücke wurden bei Isolaten der gleichen Probe gesehen, aber es gab zwei Stämme in einer Probe mit unterschiedlichen Fingerabdrücken . L. monocytogenes hatte eine hohe genetische Diversität, und für eine gute Differenzierung der Isolate ist die Verwendung von mindestens zwei Subtypisierungsansätzen notwendig.
5. Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass aus Sicht der Lebensmittelsicherheit das Vorhandensein von L. monocytogenes in Geflügelfleisch und -produkten ein vielfältiges Gefahrenpotenzial darstellt. Dies liegt zum einen an einigen gegrillten und gebratenen Lebensmitteln auf der Basis von Hühnerfleisch, die zum Überleben von L. monocytogenes in den Endprodukten führen können, und zum anderen am Vorhandensein von multiresistenten Isolaten, die die Antibiotikaresistenz auf die Gemeinschaft übertragen. Außerdem handelte es sich bei einigen der Isolate um pathogene Serotypen, die bei Listerioseausbrüchen beim Menschen eine wichtige Rolle spielen. Die Subtypisierungsdaten zeigten die Heterogenität der L. monocytogenes-Isolate. RAPD, REP-PCR und ERIC-PCR haben eine beträchtliche Unterscheidungskraft und sind kostengünstig und weniger mühsam und zeitaufwendig.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.