要旨
Listeria monocytogenesは最も一般的な食中毒の原因菌の一つである。 鶏肉および鶏肉製品は、L. monocytogenes の病原菌がヒトに感染する際の主要な媒介物の一つである。 鶏肉製品は人々の日常的な食生活の一部であり、栄養価が高く、タンパク質の含有量が多く、脂肪の含有量が少ないことから、より注目されています。 赤身の肉に比べて鶏肉は経済的です。 そのため、細菌の繁殖に適したバーベキュー形式で消費されることが多かった。 L. monocytogenes の分離株のサブタイプ化は、疫学的調査や汚染源の特定に不可欠である。 以下の総説では、家禽類における L. monocytogenes の存在の主な側面について議論する。 L. monocytogenes のほとんどの病原性血清型は、さまざまな家禽肉製品から検出された。 残念ながら、これらの分離された病原体は、ヒトの感染症の治療に使用されている一般的な抗生物質に対して抵抗性を示すことがありました
1. Listeria monocytogenesの特徴
Listeria spp.は、直径0.5～4μm、長さ0.5～2μmの小さなグラム陽性桿菌で、非胞子形成性、通性嫌気性、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性の生物です。 Listeriaは、20～25℃では、蠕動性の鞭毛によりタンブリング運動をする。 体細胞抗原（O）とべん毛抗原（H）に基づき、Listeria monocytogenes（L. monocytogenes）には、1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7の13種類の血清型が同定されている。 マルチプレックスPCR法を用いて、4つのマーカー遺伝子を標的とすることにより、L. monocytogenesの4つの主要な血清株をIIa（血清株1/2a、1/2c、3a、3c）、IIb（1/2b、3b、4b、4d、4e）、IIc（1/2c、3c）、IVb（4b、4d、4e）の4つの異なる血清群に分類することができる。 食品や食品製造環境は、血清型1/2a、1/2b、1/2c、4bで一般的に汚染されています。 L. monocytogenesの最適生育温度は30～37℃であるが、0～45℃でも生存可能である。 L. monocytogenesは冷蔵庫の温度でも増殖し、殺菌剤に耐性があり、さまざまな表面に付着します。 加工工場に持ち込まれると、劣悪な環境下でも生き残り、長期間にわたって生息することができます . 食品業界では、L. monocytogenes はバイオフィルムを形成することができ、これが潜在的な汚染源となっています。 L. monocytogenes は自然界に広く分布している生物で、主な貯蔵庫は土壌や飼料です。 また、健康な人や動物、感染した家畜や野生動物からも分離されています。
2.リステリア症
L. monocytogenesは、人の食中毒であるリステリア症の主な原因菌です。 まれに、L. ivanoviiやL. seeligeriによる食中毒も報告されています。 L. monocytogenes の菌株は、病原性が非常に強いものもあれば、非感染性のものもあり、その病原性は様々です。 L. monocytogenes の病原性を判定することは，食品安全や公衆衛生の観点から重要である． L. monocytogenesの病原性に直接関係するいくつかの遺伝子を追跡することで、病原性を有する株を特定することができる。 L. monocytogenesは、internalinsと呼ばれる表面タンパク質のファミリー、特にInlAとinlBを用いて宿主細胞内に侵入する。 さらに、InlCとInlJもL. monocytogenesの感染の腸管後の段階に関与している。 L. monocytogenesの推定上のinternalinsは、inlC (lmo1786)とinlJ (lmo2821)の遺伝子にコードされている。 ヒトのリステリア症の病因菌は inlJ (lmo2821) である。 L. monocytogenesは、リステリオライシンO（LLO）と呼ばれる孔を形成する毒素（58KDaのタンパク質で、hlyA遺伝子によってコードされる）を保有しており、この毒素はこの細菌の病原性に不可欠である。 LLOは液胞の膜を溶かし、最終的にL. monocytogenesの細胞質への侵入を助けます。 L. monocytogenesの病原性を評価するために、いくつかの方法が用いられてきた。 L. monocytogenesの病原性を評価する方法としては、マウス病原性評価法、細胞培養法、特定の遺伝子やタンパク質を用いる方法などがある。 表1は、家禽から分離されたL. monocytogenesの病原性を判定するために使用されたいくつかの特定の遺伝子を示しています。
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
食中毒のリステリア症は、髄膜炎、敗血症、流産の3つの主要な臨床症状があります。 健康な人では熱性胃腸炎を引き起こしますが、感受性の高い人（子供、高齢者、免疫不全者、妊婦）では敗血症や髄膜炎を引き起こす可能性があります。
リステリア症はヨーロッパでは4番目に多い人獣共通感染症で、年間発生率は人口10万人あたり0.41人です。 アジア諸国では、発見や報告がなされないため、リステリア症の報告はほとんどありません。 また、発生率が低いことや、臨床医がリステリア症を鑑別診断の対象外としていることも原因の一つと考えられます。
L. monocytogenesは、インドでは自然流産や死産の病因の1つとされています。
65歳以上の人と新生児がL. monocytogenesに感染する率が最も高いという結果が出ています。 新生児への母親からの感染は79%の症例で報告されています。 リステリア症は食中毒の中でも致死率が最も高い疾患です。
3. L. monocytogenes のサブタイプ化
L. monocytogenes は多様な株を持っているため、集団遺伝学、発生源の追跡、および疫学調査のために分離株のサブタイプ化を行うことは、リステリア症の制御と予防に不可欠です。 L. monocytogenes のタイピングは、汚染源を特定し、食品由来のリステリア症の発生を調査するために必要です。 表現型および遺伝子型による亜型化は、研究者によって使用された 2 つの主な方法です。 表現型法としては、病気の発生に関連する L. monocytogenes の菌株には一般的にセロタイピングが用いられる。 リステリア症の発生には 3 つの血清型しか関与しておらず、血清型 4a、4b、および 4c を区別する上での血清型判定の識別力は低いため、血清型判定は L. monocytogenes のサブタイプ判定には十分な力を持っていません。 そこで，Random Amplification of Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction（RAPD-PCR），Repetitive Extragenic Palindromes-PCR（REP-PCR），Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR（ERIC-PCR），Pulsed Field Gel Electrophoresis（PFGE）などのPCRを用いたサブタイピング法が注目されている。 RAPD法は、L. monocytogenesのゲノム中のランダムな領域を増幅して、異なるパターンを生成するものです。 RAPD法は、他のタイピング法に比べてコスト効率が高く、特に少数の菌株の場合には迅速に行うことができます。 RAPD-PCR技術は、細菌株の特性評価の主要な方法の一つです。 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) は、Listeria の明確なフィンガープリントを生成することができる、信頼性が高く、シンプルで経済的な方法です。 ERIC-PCR分析は、同じ血清型の分離株を分離することができます。
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisms）は、L. monocytogenesのハウスキーピング遺伝子や病原性関連遺伝子（hly, actA, inlAなど）の1つまたはいくつかを増幅し、PCR産物を制限酵素で消化する方法です。 実験に必要なDNAのコピー数は少なくて済みます。 しかし、識別力は低く、他のサブタイピング技術と併用する必要があり、また、RAPDアッセイよりも高価です。 L. monocytogenes分離株の遺伝子型を決定する他の方法の一つに、増幅断片長多型（AFLP）法があります。 AFLP法では，分離株のDNAをEcoRI，MseI，TaqIのいずれかの制限酵素で消化する。 AFLP法の主な利点の1つは、この検査の高い識別力である。
PFGEは、大きなDNA断片に変化する電場を当てることで、分離株をサブタイプ化する手法です。
L. monocytogenesは、35-40bpの反復性のある遺伝子外パリンドローム（REP）のような、ランダムに分散した反復性のある配列要素も持っています。 これらの領域は、L. monocytogenesの分離株を区別するための有用なポイントとなる。 REP-PCRを用いて、分離された株の起源を特定した。 REP-PCRはPFGEと同等の識別性を有している。
4. 家禽類におけるListeria
4.1. 家禽におけるListeria Spp.およびL. monocytogenesの有病率
リステリア菌の主な感染源の一つは家禽群であり、不衛生な習慣により環境や家禽の死体に菌を拡散させる可能性があります。 時折、家禽や鶏の糞からListeriaが分離されることがあります。 リステリア属菌は、様々な鶏肉製品から検出されました。 他の研究によると、8%から99%の家禽製品がListeria spp.に汚染されていました.
L. monocytogenesはこれまで、生の製品から調理済みの製品まで、さまざまな家禽製品から報告されてきました. Schäferら（2018）は、鶏肉の胸肉と腿肉のサンプルの汚染率をそれぞれ8.64％と44.19％と報告しています 。 七面鳥の肉の12.7%がL.monocytogenesに陽性であった 。 表2は、Listeria spp.およびL. monocytogenesによる鶏肉および鶏肉製品の汚染率を示しています。
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表2によると、生の鶏肉および鶏肉製品は調理済みのものよりもL. monocytogenesに汚染されていました。 家禽におけるListeria monocytogenesの血清型
イランの鶏の枝肉では、L. monocytogenesの血清型1/2bおよび3b（セログループIIb）が52.77%と最も多く分離され、4aおよび4cを含むIVaセログループも27.77%の鶏の枝肉で検出されました。 米国では、鶏肉製品に最も多く含まれる血清型は同じでした。 しかし、別の研究では、鶏肉製品で最も一般的な血清型として血清型4bが報告されており、サンプルの44.9%から検出されましたが、血清型1/2bの有病率は10.2%でした。
鶏の枝肉とRTE食品におけるセログループIVbの有病率は、それぞれ2.77%と12.5%でした。 ヒトのリステリア症は主にL. monocytogenesの1/2a、1/2b、4b血清型によって引き起こされる。
フレッシュパックされた七面鳥の肉サンプルは、以下のようなL. monocytogenesの血清型に汚染されていました。
新鮮な七面鳥の肉サンプルは、4b（または4d、4e）（51.4％）、1/2a（または3a）（27.0％）、1/2b（または3b）（21.6％）の血清型に汚染されていた。
イランでサンプリングされた鶏肉の約16.66%が、1/2a、3a、1/2c、3cの血清型を含むセログループIIaに汚染されていました。 鶏肉製品を対象とした別の血清学的研究では、サンプルの40.8%が1/2a血清型、4.08%が1/2c血清型であったと報告されています。 他の研究では、ポルトガルとエストニアの鶏肉製品では1/2a血清型が主であり、フィンランドでは1/2cが主であった。RTE食品で確認された血清群は、1/2a、3aおよび1/2c、3cで、それぞれ65.6％と21.9％であった。 以上の研究結果から、鶏肉はL. monocytogenesの病原性血清型の潜在的な供給源であることが明らかになりました。 Listeria monocytogenes の抗菌薬感受性
Listeria spp.は、移動性の遺伝要素や共役トランスポゾンが広く存在するため、抗菌薬に対して耐性があります。 36株のL. monocytogenesのうち12株は、11種類の抗菌剤に感受性を示しました。 また，アンピシリンとバンコマイシンに耐性を示した株はなかった． 一部の研究者は、L. monocytogenes の分離株にアンピシリンに対する耐性を認めたが、その分離株はすべてバンコマイシンに感受性を示した。 Zeinali ら（2017）は、L. monocytogenes の 52.77% にエリスロマイシン耐性を認めていますが、別の研究では 15.2% であると報告しています。 L. monocytogenesの23株のうち8株がエリスロマイシンに耐性を示した。 ペニシリンに対する耐性は，多くの研究で共通して認められている． また，アンピシリンやペニシリンに対するL. monocytogenesの高い感受性も報告されている． テトラサイクリンは、養鶏場で頻繁に使用されている抗菌剤で、ヒトの感染症の治療にも用いられています。 L. monocytogenesには、この薬剤に対する耐性が常に認められる。 ゲンタマイシンに耐性を示した分離株の数は少なかった。 リステリア症の標準的な治療法は、アンピシリンまたはペニシリンGと、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシドを併用することです。 2番目の治療法はトリメトプリムです。 L. monocytogenesのトリメトプリムに対する耐性は、pIP823プラスミドによるものです。 食品から分離されたL. monocytogenesには、この薬剤に対する高い感受性が認められます。 ほとんどのL. monocytogenes分離株は多剤耐性を有していた。 幸いなことに、これらの菌はヒトのリステリア症の治療に使用されていた一般的な抗生物質にはほとんど感受性があります。 家禽から分離されたL. monocytogenesのタイピング
同じRAPDクラスターを持つL. monocytogenesの分離株は、異なる血清群に属していました。 鶏の死骸から分離されたL. monocytogenes 26株について、OPM-01、HLWL 74、D8635の3種類のプライマーを用いたRAPD分析を行ったところ、4つの異なるクラスターが検出された。
類似したパルスタイプを持つL. monocytogenesの分離株は、RAPD分析で同じクラスターに分類されました。
パルスタイプが似ているL.monocytogenesは、RAPD法では同じクラスターに分類され、クローン的に関連しています。
REP-PCRでは区別がつかなかったが、RAPDではRTE食品から分離されたいくつかの株がタイプ分けされた。 鶏肉から分離された28のL. monocytogenesは27のRAPDタイプを持っていました。
アヒルから分離されたL. monocytogenesの15株は、3つのアンチバイオグラムパターン、5つのRAPDクラスター、3つのシングルトンを持っていました。
鶏とヒトから分離されたL. monocytogenesは、RAPD法では5つのクラスターに分類されました。 ヒトからの分離株はすべて1つのクラスターに分類されました。 これらの分離株は異なる血清群を持っていました。 これは他の研究でも共通して見られた結果です。 これは、RAPD検査で特異的でない遺伝子座が増幅されたためであると考えられる。 遺伝的な類似性は、サンプリング地域が共通している単離株の間で見られた。 同じRAPDクラスターが、共通の供給源からのいくつかのLactobacillus株に見られた。 RAPDテストの識別力は、血清型別よりも高い。
L. monocytogenesの29の分離株と5つの参照株は、REP-PCRによって4つのクラスターと1つのシングルトンに分類されました。 単離された菌の間には高い遺伝的多様性がありました。 Shiら（2015）によると、同じ血清型と起源に属する分離株は、REP-PCRで同じクラスタを持っていた。 アヒルとその環境から分離されたL. monocytogenesの15株をRAPDとREPで型別した。 これらはそれぞれ5つのクラスターと3つのシングルトン、および2つのクラスターと3つのシングルトンに分類された。 この結果は、これらのツールが菌株の識別に適していることを示唆している。 Soniら（2012）も、L. monocytogenesの臨床分離株はERICとREPのフィンガープリントが類似しているが、水や牛乳から分離された株とは全く異なることを観察している 。 Oliveiraら（2018）は、L. monocytogenesの38の分離株のうち、12のパルソタイプを発見した 。 L. monocytogenesの40分離株は、ERIC-PCRで10種類のフィンガープリントプロファイルを生成した。 同じサンプルから分離された菌株には類似したフィンガープリントが見られたが、1つのサンプルに2つの異なるフィンガープリントを持つ菌株が存在した。 L. monocytogenesは高い遺伝的多様性を有しており、分離株を良好に鑑別するためには、少なくとも2つのサブタイプ化アプローチを用いる必要があると考えられる。 結論
結論として、食品安全の観点からは、鶏肉および製品中の L. monocytogenes の存在は多面的な潜在的危険性があります。 これは、第一に、鶏肉をベースにしたバーベキューや揚げ物があるため、最終製品にL. monocytogenesが残存する可能性があること、第二に、抗生物質耐性を地域社会に移す多剤耐性分離株が存在することによるものである。 また、分離された菌の中には、ヒトのリステリア症の発生に大きな役割を果たす病原性血清型も含まれていました。 Subtypingデータは、L. monocytogenes分離株の異質な性質を明らかにした。 RAPD、REP-PCR、ERIC-PCRはかなりの識別力があり、費用対効果が高く、面倒な作業や時間がかかりません。
Conflicts of Interest（利益相反）
著者は利益相反がないことを宣言します
。