Ácidos nucleicos virais são instáveis quando recolhidos, manuseados e armazenados de forma imprópria, resultando numa diminuição da sensibilidade dos kits comerciais de teste quantitativo de ácidos nucleicos actualmente disponíveis. Utilizando o conhecido RNA do vírus da hepatite C instável, desenvolvemos um método RT-PCR quantitativo baseado numa nova estratégia de desenho de primer para reduzir o impacto da instabilidade do ácido nucleico nos testes de ácido nucleico. O desempenho do método foi avaliado quanto à linearidade, limite de detecção, precisão, especificidade, e concordância com os ensaios comerciais do vírus da hepatite C. A sua aplicação clínica foi comparada à de dois kits comerciais-Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) e Kehua. O método quantitativo RT-PCR proporcionou um bom desempenho, com uma linearidade de R2 = 0,99, um limite total de detecção (genótipos 1 a 6) de 42,6 IU/mL (95% CI, 32,84 a 67,76 IU/mL), um CV de 1.06% a 3,34%, uma especificidade de 100%, e uma alta concordância com o ensaio CAP/CTM (R2 = 0,97), com um valor médio ± SD de -0,06 ± 1,96 UI/mL de log (intervalo, -0,38 a 0,25 UI/mL de log). O método foi superior aos ensaios comerciais na detecção do RNA do vírus da hepatite C instável (P < 0,05). Este método quantitativo RT-PCR pode eliminar eficazmente a influência da instabilidade do RNA no teste do ácido nucleico. O princípio da estratégia de concepção do primer pode ser aplicado à detecção de outros vírus de RNA ou de ADN.