Les acides nucléiques viraux sont instables lorsqu’ils sont mal collectés, manipulés et stockés, ce qui entraîne une diminution de la sensibilité des kits de tests quantitatifs d’acides nucléiques commerciaux actuellement disponibles. En utilisant l’ARN du virus de l’hépatite C instable connu, nous avons développé une méthode de RT-PCR quantitative basée sur une nouvelle stratégie de conception d’amorces pour réduire l’impact de l’instabilité des acides nucléiques sur les tests d’acides nucléiques. La performance de la méthode a été évaluée en termes de linéarité, de limite de détection, de précision, de spécificité et de concordance avec les tests commerciaux du virus de l’hépatite C. Son application clinique a été comparée à celle de deux kits commerciaux – Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) et Kehua. La méthode RT-PCR quantitative a donné de bons résultats, avec une linéarité de R2 = 0,99, une limite de détection totale (génotypes 1 à 6) de 42,6 UI/mL (IC 95 %, 32,84 à 67,76 UI/mL), un CV de 1.06 % à 3,34 %, une spécificité de 100 % et une concordance élevée avec le test CAP/CTM (R2 = 0,97), avec une valeur moyenne ± SD de -0,06 ± 1,96 log UI/mL (intervalle, -0,38 à 0,25 log UI/mL). La méthode était supérieure aux tests commerciaux pour détecter l’ARN instable du virus de l’hépatite C (P < 0,05). Cette méthode de RT-PCR quantitative peut éliminer efficacement l’influence de l’instabilité de l’ARN sur l’analyse des acides nucléiques. Le principe de la stratégie de conception des amorces peut être appliqué à la détection d’autres virus à ARN ou à ADN.