Gli acidi nucleici virali sono instabili se raccolti, manipolati e conservati in modo improprio, con conseguente riduzione della sensibilità dei kit di analisi quantitativa degli acidi nucleici attualmente disponibili. Utilizzando l’RNA del virus dell’epatite C noto e instabile, abbiamo sviluppato un metodo RT-PCR quantitativo basato su una nuova strategia di progettazione dei primer per ridurre l’impatto dell’instabilità dell’acido nucleico sui test dell’acido nucleico. Le prestazioni del metodo sono state valutate per la linearità, il limite di rilevazione, la precisione, la specificità e l’accordo con i test commerciali del virus dell’epatite C. La sua applicazione clinica è stata confrontata con quella di due kit commerciali-Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) e Kehua. Il metodo RT-PCR quantitativo ha fornito una buona performance, con una linearità di R2 = 0,99, un limite totale di rilevazione (genotipi da 1 a 6) di 42,6 IU/mL (95% CI, da 32,84 a 67,76 IU/mL), un CV di 1.06% al 3,34%, una specificità del 100% e un’elevata concordanza con il test CAP/CTM (R2 = 0,97), con un valore medio ± SD di -0,06 ± 1,96 log IU/mL (range, da -0,38 a 0,25 log IU/mL). Il metodo è stato superiore ai test commerciali nel rilevare l’RNA instabile del virus dell’epatite C (P < 0,05). Questo metodo RT-PCR quantitativo può eliminare efficacemente l’influenza dell’instabilità dell’RNA sul test dell’acido nucleico. Il principio della strategia di progettazione del primer può essere applicato al rilevamento di altri virus RNA o DNA.