5.6 DNA-Mimicking Peptides Bound by Anti-dsDNA Antibodies
Opracowanie specyficznych inhibitorów patogennych przeciwciał anty-dsDNA było wyzwaniem. Niemniej jednak, ponieważ peptydy mogą naśladować antygenowość DNA, mogą one prawdopodobnie blokować wiązanie przeciwciał anty-dsDNA do autoantygenów poprzez konkurowanie z DNA o miejsca wiązania. Dlatego peptydowe mimetyki DNA mogą zapobiegać odkładaniu się przeciwciał anty-dsDNA w nerkach (i / lub innych organach) i wynikającemu z tego uszkodzeniu tkanek. Wykazano, że kilka peptydów wykazuje takie właściwości.
Hipoteza, że epitopy peptydowe mogą naśladować strukturę DNA została po raz pierwszy wykazana w eksperymentach in vitro. R4A jest mysim przeciwciałem anty-dsDNA o izotypie IgG2b, które odkłada się w kłębuszkach nerkowych i wywołuje uszkodzenie histologiczne po podaniu in vivo.80 Wykorzystując biblioteki fagowe z wyświetlaczem peptydowym, zidentyfikowano kilka peptydów, które specyficznie reagowały z R4A.81 Peptydy te wiązały się preferencyjnie z R4A w porównaniu z dwoma blisko spokrewnionymi przeciwciałami (95 i 52b3) wygenerowanymi przez mutagenezę ukierunkowaną miejscowo, które jednak różniły się znacznie od macierzystego R4A pod względem potencjału nefrytogennego.80 Dalsze wsparcie, że peptyd może służyć jako molekularny mimik DNA, można znaleźć w badaniach, w których podanie formy D peptydu specyficznego dla R4A (DWEYS) chroniło myszy przed nerkowym odkładaniem się przeciwciała R4A.80
Jeśli peptydy izolowane za pomocą technologii bibliotek fagowych mogą wykazywać aktywność mimotopową (tj. naśladować strukturę epitopu), wywoływałyby odpowiedź przeciwciała podobną do tej stymulowanej przez oryginalny epitop. W celu określenia, czy surogaty peptydowego DNA mogą wywoływać przeciwjądrowe odpowiedzi autoimmunologiczne, myszy BALB/c immunizowano peptydem DWEYSVWLSN w formie multimeryzowanej. Niespodziewanie, około 3 tygodnie po pierwszej immunizacji, u tego pierwotnie nieautoimmunologicznego szczepu myszy zaczęły powstawać wysokie miana przeciwciał IgG przeciwkodsDNA.84 Immunizowane myszy wytwarzały również przeciwciała przeciwko innym autoantygenom i wykazywały odkładanie się IgG w nerkach. Rzeczywiście, te wywołane peptydami przeciwciała anty-dsDNA były strukturalnie podobne do spontanicznie pojawiających się autoprzeciwciał u myszy podatnych na toczeń.82 Dlatego immunizacja wyizolowanym peptydem z fagami może stymulować patogenną, podobną do tocznia odpowiedź anty-dsDNA u myszy nieautoimmunologicznych. W podobnym typie eksperymentu trzy monoklonalne przeciwciała IgG2a anty-dsDNA uzyskano od myszy ze szczepu NZB × NZW F1 podatnych na toczeń.83 Peptydy wyselekcjonowane przez te przeciwciała mogły wiązać się z przeciwciałami surowicy od ludzkich pacjentów z SLE. Ponadto myszy BALB/c immunizowane tymi peptydami wykazywały zwiększoną ilość przeciwciał IgG3 anty-dsDNA w surowicy.83 Tak więc, oprócz przyczyniania się do naszego zrozumienia rozprzestrzeniania się epitopów, które występuje w toczniu, te modele autoimmunizacji wywołanej peptydami mogą również pomóc w identyfikacji potencjalnych antygenów blokujących, które mogłyby być terapeutyczne. Immunoterapie bierne oparte na peptydach, dzięki temu, że skupiają się na blokowaniu wiązania przeciwciał do narządów docelowych i w ten sposób zapobiegają późniejszym uszkodzeniom (raczej niż poprzez nieswoistą immunosupresję, która również zakłóca odporność ochronną), mogą stać się nowym podejściem terapeutycznym w leczeniu tocznia.
Podobne eksperymenty przeprowadzono z ludzkimi autoprzeciwciałami tocznia.87 Stwierdzono, że oczyszczone do powinowactwa poliklonalne ludzkie IgG anty-dsDNA wiążą specyficznie 15-merowy peptyd ASPVTARVLWKASHV. ASPVTARVLWKASHV wiązał się z przeciwciałami anty-dsDNA w testach ELISA i dot blot i hamował wiązanie przeciwciał anty-dsDNA.87
Jak wspomniano wcześniej, ALW jest 12-merowym peptydem wybranym przez panel mysich IgG anty-DNA (PL9-11 IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3), które mają identyczne regiony zmienne.41 Wiązanie PL9-11 IgGs z antygenami, w tym z DNA, lamininą, komórkami nerek i kłębuszkami szczurów było znacznie zmniejszone po preinkubacji z ALW. Ponadto, poprzez skanowanie alaniny, potwierdziliśmy, że wiązanie ALW z przeciwciałami anty-DNA było specyficzne dla sekwencji aminokwasów. Co ciekawe, wiązanie surowic tocznia pochodzących zarówno z modeli mysich, jak i od pacjentów ludzkich do dsDNA oraz, co ważne, do antygenów kłębuszkowych, było znacząco hamowane przez peptyd ALW. Peptydy naśladujące DNA opisane wcześniej zostały wybrane przez jeden izotyp lub surowice tocznia, podczas gdy peptyd ALW wiąże się ze wszystkimi czterema izotypami IgG i powinien szerzej hamować patogenne poliklonalne odpowiedzi przeciwciał anty-DNA in vivo.41 ALW jest małą cząsteczką, która może łatwo rozpuścić się w H2O lub standardowym buforze (PBS), a także może być łatwo podawana przez żyłę. Co więcej, peptyd ALW jest prawdopodobnie fizjologicznie stabilny; ALW nie zawiera w swojej sekwencji reszt metioniny, cysteiny i glutaminy, które, jak się uważa, są odpowiedzialne za utlenianie, cyklizację i degradację peptydów.84 Ponadto ALW ma względnie neutralną wartość pI (7,38), co może prowadzić do mniej niespecyficznych i niepożądanych interakcji z innymi cząsteczkami.41 Dlatego też peptyd ALW i jego analogi są potencjalnymi kandydatami do opracowania nowych metod terapeutycznych w leczeniu SLE. Ponadto, naszym roboczym założeniem jest, że kombinacja różnych peptydów, wybranych za pomocą różnych podejść, może być konieczna, ponieważ patogenne autoprzeciwciała obecne w toczniu są wysoce zmienne i krzyżowo reaktywne.41 Wreszcie, w przeciwieństwie do opisanych wcześniej modeli autoimmunizacji wywołanej peptydami, w których peptyd jest podawany w warunkach immunogennych (podskórnie, w adiuwancie), w kontekście terapeutycznym peptydy podawane dożylnie bez adiuwantu nie powinny być tak immunogenne. Ponieważ oczekuje się, że peptydy w tym ostatnim scenariuszu będą miały niską toksyczność, podejście kombinowane może zwiększyć skuteczność inhibicji i poprawić wyniki kliniczne.
Najwyraźniej różne peptydy mogą być izolowane przy użyciu przeciwciał anty-dsDNA o różnym pochodzeniu jako „przynęty”. Chociaż nie ma dużego podobieństwa w strukturze między już zidentyfikowanymi peptydami, interesującym zjawiskiem jest to, że reszty tryptofanowe występują w podobnych pozycjach zarówno w peptydach DWEYSVWLSN (wybrane przeciwciało mysie), jak i ALW (wybrane przeciwciało ludzkie). Bezpośrednie porównanie względnej skuteczności blokowania tych peptydów naśladujących DNA nie byłoby niestety odkrywcze ze względu na różnice wielkości. Fakt, że w różnych badaniach wyizolowano odmienne peptydy można wytłumaczyć tym, że w procesie przesiewowym użyto różnych przeciwciał anty-dsDNA. Na przykład, DWEYSVWLSN i ASPVTARVLWKASHV zostały wybrane odpowiednio przez monoklonalne przeciwciało IgG2b mysiego anty-dsDNA i przeciwciała anty-dsDNA oczyszczone z ludzkich surowic tocznia.80,87 Dlatego te przeciwciała anty-dsDNA mogą wykazywać stronniczy potencjał wiązania i potencjalnie wybierać różne peptydy naśladujące DNA. Co więcej, rodzaj i złożoność zastosowanej biblioteki fagowej może również wpływać na wyniki badania przesiewowego peptydów.41 Niemniej jednak, każdy z tych peptydów może wiązać się ze specyficznymi podgrupami anty-DNA i możliwe jest, że lepszą odpowiedź terapeutyczną można uzyskać poprzez zastosowanie kilku peptydów w połączeniu.